Technique de préparation d’une culture bactérienne monoclonale

Résumé

Source : Lin, P., et al. Synthèse de microcapsules de tungstate de sodium et de molybdate de sodium par excrétion de minéraux bactériens. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre la préparation d’une culture bactérienne monoclonale pour la production minérale par dilution en série et isolement de colonie sur une plaque de gélose. En secouant la plaque avec des billes de verre, les cellules individuelles sont séparées spatialement pour former des colonies génétiquement uniformes, qui sont ensuite transférées dans un milieu liquide pour la croissance. La culture ayant la turbidité la plus élevée est sélectionnée, indiquant la population monoclonale la plus dense et le plus grand potentiel de production minérale.

Protocole

1. Préparation des perles de verre

1. Placez 100 billes de verre de 3 mm de diamètre dans un flacon de laboratoire de 100 ml, puis bouchez-le hermétiquement.
2. Autoclave le contenu à 120 °C pendant 10 min.
3. Laissez la bouteille refroidir à température ambiante, puis placez-la dans l’enceinte de biosécurité.

2. Préparation du bouillon de lysogénie (LB)

1. Dissoudre 8 g de poudre de bouillon LB-Lennox dans une bouteille de laboratoire de 500 mL avec 400 mL d’eau.
2. Mélangez le contenu avec une barre d’agitation magnétique en polytétrafluoroéthylène (PTFE) pendant 20 min, puis bouchonnez-le hermétiquement.
3. Autoclave le contenu à 120 °C pendant 10 min.
4. Laissez la solution refroidir à température ambiante et placez-la dans l’enceinte de biosécurité.
5. À l’aide d’une pipette, aliquote le bouillon dans huit tubes à centrifuger de 15 mL (12,5 mL chacun) dans l’enceinte de sécurité biologique.
6. Aliquote le reste du bouillon dans trois bouteilles de laboratoire de 100 mL dans l’enceinte de biosécurité (100 mL chacune). Fermez bien les trois bouteilles. Conservez-les dans l’enceinte de biosécurité.

3. Culture de l’algue Shewanella

1. Utilisez la souche cryoconservée surgelée.
2. Dans l’enceinte de sécurité biologique, prélever 1 mL de matière congelée dans le tube congelé à l’aide d’une spatule en acier inoxydable et le placer dans un tube à centrifuger préparé à l’étape 3.5.
3. Incuber les cultures pendant 24 h dans un incubateur à 37 °C.

4. Préparation des boîtes de Pétri LB-Lennox (bouillon à l’agar)

1. Dissoudre deux comprimés de LB-Lennox (bouillon à l’agar) dans une bouteille de laboratoire de 100 ml avec 100 ml d’eau.
2. Mélangez le contenu avec une barre d’agitation magnétique en PTFE pendant 20 min, puis fermez hermétiquement.
3. Autoclave le contenu à 120 °C pendant 10 min.
4. Dans l’enceinte de biosécurité, aliquote à la main 100 mL de solution dans 4 boîtes de Pétri, en veillant à ce que chacune reçoive ~25 mL. Laissez la solution refroidir à température ambiante.

5. Préparation de bactéries monoclonales

1. Dans l’enceinte de biosécurité, étiquetez les trois bouteilles préparées aux étapes 2.6, #1, #2 et #3, respectivement.
2. Pipeter 0,1 mL de la suspension bactérienne résultante à l’étape 3.3 dans le flacon #1. Bouchez le flacon et faites-le pivoter à la main pendant 1 min pour obtenir une solution homogène.
3. Pipeter 0,1 mL du liquide bactérien résultant à l’étape 5.2 dans le flacon #2. Bouchez le flacon et faites-le pivoter à la main pendant 1 min pour obtenir une solution homogène.
4. Pipeter 0,1 mL du liquide bactérien résultant à l’étape 5.3 dans le flacon #3. Bouchez le flacon et secouez-le à la main pendant 1 min pour obtenir une solution homogène.
5. Pipeter le liquide du flacon #3 dans les 4 boîtes de Pétri préparées à l’étape 4.4, en utilisant un volume de 0,02 mL chacune.
6. Mettez les perles de verre préparées à l’étape 1.3 dans les 4 boîtes de Pétri utilisées, 4 perles dans chaque plat.
7. Fermez les couvercles des boîtes de Pétri et secouez-les à la main pendant 1 min.
8. Retournez les boîtes de Pétri et incubez dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h.

6. Multiplication des bactéries monoclonales

1. Récupérez 7 tubes préparés à l’étape 2.5.
2. Prélevez les bactéries monoclonales résultantes dans les 4 boîtes de Pétri préparées à l’étape 5.8 avec une spatule en acier inoxydable, et mettez-les dans 7 tubes séparément.
3. Laissez les 7 tubes dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h.
4. Choisissez celui qui diffuse la lumière le plus à l’aide de la méthode colorimétrique visuelle.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
LB (bouillon Lennox) avec comprimés de gélose	Sigma-Aldrich	L7075	1 comprimé pour 50 mL de bouillon avec gélose
LB (bouillon Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) en poudre 1 kg
Dextrose anhydre	Réactif Nihon Shiyaku	Réf. PL 78695	glucose
Tube de centrifugation de 50 mL	Faucon	14-432-22
Tube de centrifugation de 15 mL	Faucon	Référence 14-959-53A
Flacon de laboratoire 100 mL	Duran	21 801 24 5
Flacon de laboratoire 500 mL	Duran	21 801 44 5
Spatule en acier inoxydable	Verre chimique	Réf. CG-1981-10
Barres d’agitation jetables en PTFE	Pêcheur	Réf. S68066
Boîtes de Pétri en plastique	Pêcheur	S33580A
Incubateur	Fabriqué par le client	Sur mesure	chauffer à 40 °C ou refroidir à 18 °C avec contrôle temporisé
Enceinte de biosécurité	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Tous les processus liés aux bactéries sont effectués ici
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei, Taïwan, République de Chine	TM-329	chauffer à 120 °C pendant 10 min