Synthèse de microcapsules d’oxyde métallique à l’aide de bactéries réductrices de métaux

Résumé

Source : Lin, P., et al. Synthèse de microcapsules de tungstate de sodium et de molybdate de sodium par excrétion de minéraux bactériens. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre la procédure de synthèse de microcapsules d’oxyde métallique rigide en cultivant des bactéries réductrices de métaux avec des ions métalliques, suivie d’une purification séquentielle par sonication, centrifugation et lavage à l’éthanol.

Protocole

ATTENTION : Utilisez des gants en latex, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire pour réaliser l’expérience. Chaque fois que vous utilisez l’enceinte de biosécurité, allumez le ventilateur de l’armoire et gardez la porte de l’armoire à moitié fermée.

1. Préparation des perles de verre

1. Placez 100 billes de verre de 3 mm de diamètre dans un flacon de laboratoire de 100 ml, puis bouchez-le hermétiquement.
2. Autoclave le contenu à 120 °C pendant 10 min.
3. Laissez la bouteille refroidir à température ambiante, puis placez-la dans l’enceinte de biosécurité.

2. Préparation du bouillon de lysogénie (LB)

1. Dissoudre 8 g de poudre de bouillon LB-Lennox dans une bouteille de laboratoire de 500 mL avec 400 mL d’eau.
2. Mélangez le contenu avec une barre d’agitation magnétique en PTFE (polytétrafluoroéthylène) pendant 20 min, puis bouchonnez-le hermétiquement.
3. Autoclave le contenu à 120 °C pendant 10 min.
4. Laissez la solution refroidir à température ambiante et placez-la dans l’enceinte de biosécurité.
5. À l’aide d’une pipette, aliquote le bouillon dans huit tubes à centrifuger de 15 mL (12,5 mL chacun) dans l’enceinte de sécurité biologique.
6. Placez le reste du bouillon dans trois bouteilles de laboratoire de 100 mL (100 mL chacune) dans l’enceinte de biosécurité. Fermez hermétiquement les trois bouteilles et conservez-les dans l’enceinte de biosécurité.

3. Culture de l’algue Shewanella

1. Utilisez la souche cryoconservée surgelée.
2. Dans l’enceinte de sécurité biologique, prélever 1 mL de matière congelée dans le tube congelé à l’aide d’une spatule en acier inoxydable et le placer dans un tube à centrifuger préparé à l’étape 3.5.
3. Incuber les cultures pendant 24 h dans un incubateur à 37 °C.

4. Préparation des boîtes de Pétri LB-Lennox (bouillon à l’agar)

1. Dissoudre deux comprimés de LB-Lennox (bouillon à l’agar) dans une bouteille de laboratoire de 100 ml avec 100 ml d’eau.
2. Mélangez le contenu avec une barre d’agitation magnétique en PTFE pendant 20 min, puis fermez hermétiquement.
3. Autoclave le contenu à 120 °C pendant 10 min.
4. Dans l’enceinte de biosécurité, aliquote à la main 100 mL de solution dans 4 boîtes de Pétri, en s’assurant que chacune reçoit ~25 mL. Laissez la solution refroidir à température ambiante.

5. Préparation de bactéries monoclonales

1. Dans l’enceinte de biosécurité, étiquetez les trois bouteilles préparées aux étapes 2.6, #1, #2 et #3, respectivement.
2. Pipeter 0,1 mL de la suspension bactérienne résultante à l’étape 3.3 dans le flacon #1. Bouchez le flacon et faites-le pivoter à la main pendant 1 min pour obtenir une solution homogène.
3. Pipeter 0,1 mL du liquide bactérien résultant à l’étape 5.2 dans le flacon #2. Bouchez le flacon et faites-le pivoter à la main pendant 1 min pour obtenir une solution homogène.
4. Pipeter 0,1 mL du liquide bactérien résultant à l’étape 5.3 dans le flacon #3. Boucher le flacon et le secouer à la main pendant 1 min pour obtenir une solution homogène.
5. Pipeter le liquide du flacon #3 dans les 4 boîtes de Pétri préparées à l’étape 4.4, en utilisant un volume de 0,02 mL chacune.
6. Mettez les perles de verre préparées à l’étape 1.3 dans les 4 boîtes de Pétri utilisées, 4 perles dans chaque plat.
7. Fermez les couvercles des boîtes de Pétri et secouez-les à la main pendant 1 min.
8. Retournez les boîtes de Pétri et incubez dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h.

6. Multiplication des bactéries monoclonales

1. Récupérez 7 tubes préparés à l’étape 2.5.
2. Prélevez les bactéries monoclonales résultantes dans les 4 boîtes de Pétri préparées à l’étape 5.8 avec une spatule en acier inoxydable, et mettez-les dans 7 tubes séparément.
3. Laissez les 7 tubes dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h.
4. Choisissez celui qui diffuse la lumière le plus à l’aide de la méthode colorimétrique visuelle.

7. Préparation du bouillon LB-Lennox avec du glucose et du sel

1. Mettez 10 g de bouillon LB-Lennox, 10 g de NaCl et 10 g de glucose dans une bouteille de laboratoire de 500 ml. Ajouter de l’eau jusqu’à ce que le volume atteigne 450 ml.
2. Mélangez le contenu avec une barre d’agitation magnétique en PTFE pendant 20 min.
3. Autoclave le contenu à 120 °C pendant 10 min.

8. Préparation du tungstate de sodium

1. Mettez 16,5 g de tungstate de sodium Na₂WO_{4.2H 2}O dans une bouteille de laboratoire de 100 ml à l’aide d’une spatule en acier inoxydable. Ajouter de l’eau jusqu’à ce que le volume atteigne 50 ml.
2. Mélangez le contenu avec une barre d’agitation magnétique en PTFE pendant 20 min.
3. Autoclave le contenu à 120 °C pendant 10 min.
4. Dans l’enceinte de biosécurité, obtenez le filtrat via un filtre sous vide en fibre de verre avec des pores de 1 μm.

9. Préparation de LB avec du glucose, du sel et du tungstate de sodium

1. Dans l’enceinte de biosécurité, versez à la main le filtrat obtenu à l’étape 8.4 dans la solution avec le glucose et le sel préparée à l’étape 7.3.
2. Dans l’enceinte de biosécurité, aliquote à l’aide d’une pipette la solution résultante de 500 mL à l’étape 9.1 dans des tubes à centrifuger de 10 x 50 mL.

10. Culture de bactéries

1. Dans l’enceinte de biosécurité, aller chercher le liquide préparé à l’étape 6.4 et l’aliquoter à l’aide d’une pipette dans les 10 tubes à essai préparés à l’étape 9.2, chaque tube recevant 0,05 mL.
2. Incuber les 10 tubes dans un incubateur à 37 °C pendant 120 h.

11. Récolte des minéraux BME

1. Échoçonnez chacun des 10 tubes de l’étape 9.2 à 20 KHz avec 150 W pendant 1 h.
2. Centrifuger les tubes à 2 025 x g pendant 1 h.
3. Retirez le liquide clair dans les tubes à l’aide d’une pipette, ajoutez de l’eau, puis répétez les étapes 11.1 et 11.2 une fois de plus.
4. Prélevez le liquide clair dans les tubes à l’aide d’une pipette, ajoutez de l’alcool, puis ultrasonisez-les à 20 KHz avec 150 W pendant 1 h.
5. Centrifuger les tubes à 2 025 x g pendant 1 h.
6. Répétez les étapes 11.4 et 11.5 une fois de plus
7. Récoltez les minéraux BME en retirant le liquide clair dans les tubes à l’aide d’une pipette ; Ensuite, bouchez immédiatement les tubes sans passer par aucun processus de séchage.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
LB(Lennox)bouillon avec pastilles d’agar	Sigma-Aldrich	L7075	1 comprimé pour 50 mL de bouillon avec gélose
Bouillon LB (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) en poudre 1 kg
Dextrose anhydre	Réactif Nihon Shiyaku	Réf. PL 78695	glucose
Sodium Tungstate	Réactif Nihon Shiyaku	Réf. PL 76050	Na2WO4 · 2H2O
Chlorure de sodium	Réactif Nihon Shiyaku	Réf. PL 68131	NaCl
Éthanol 99,5 %	Acros organics	AC615090040	CH3CH2OH
Eau	Fabriqué dans notre université		Eau désionisée
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei, Taïwan, République de Chine	TM-329	chauffer à 120 °C pendant 10 min
Centrifugeuse	Système de laboratoire Digit System, New Taipei City, Taïwan, ROC	DSC302SD	centrifugeuse à 2025 x g
-80 °C Réfrigérateur	Panasonic	MDF-U3386S	Utiliser pour congeler la souche cryopreserve
Homogénéisateur à ultrasons Processeur Processeur Disrupteur	Lenox	UPS-150	fréquence 20 KHz puissance 150 W
Incubateur	Fabriqué par le client	Sur mesure	chauffer à 40 °C ou refroidir à 18 °C avec contrôle temporisé
Bains à agitation réciproque	Kingtech Scientific Co., Ltd	WBS-L
Plaque chauffante d’agitation numérique	Corning	#6797-620D	utilisation avec barre d’agitation magnétique en PTFE
Enceinte de biosécurité	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Tous les processus liés aux bactéries sont effectués ici
Tube de centrifugation de 50 mL	Faucon	14-432-22
Tube de centrifugation de 15 mL	Faucon	Référence 14-959-53A
Flacon de laboratoire 100 mL	Duran	21 801 24 5
Flacon de laboratoire 500 mL	Duran	21 801 44 5
Spatule en acier inoxydable	Verre chimique	Réf. CG-1981-10
Barres d’agitation jetables en PTFE	Pêcheur	Réf. S68066
Boîtes de Pétri en plastique	Pêcheur	S33580A
Algue Shewanella	Avec l’aimable autorisation de l’auteur #3	Avec l’aimable autorisation de l’auteur #3