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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Conception expérimentale
- Commencer le traitement des animaux par gavage oral, après 2 jours d’acclimatation. Utilisez une seringue avec l’aiguille de gavage buccal. Traiter 16 rats avec la suspension de Bacillus subtilis BSB3 (1 ml par rat) deux fois par jour pendant deux jours (groupe B. subtilis). Traiter 16 rats avec une solution saline tamponnée au phosphate, PBS (1 ml par rat), deux fois par jour pendant deux jours (groupe PBS) (figure 1).
- Après le traitement, subdivisez chaque groupe (8 rats par groupe) : Groupe 1 - contrôle (PBS/sans stress), groupe 2-B. subtilis (B. subtilis /sans stress), groupe 3 - stress (PBS/stress thermique) et groupe 4 - B. subtilis + stress (B. subtilis/stress thermique).
- Mesurez la température rectale de chaque rat à l’aide d’un thermomètre numérique électronique. Conservez les rats des groupes 1 et 2 à température ambiante pendant 25 min. Placez les animaux des groupes 3 et 4 dans une chambre climatique à 45 °C et à 55 % d’humidité relative pendant 25 min.
- Ensuite, mesurez la température rectale de chaque rat dans tous les groupes à l’aide d’un thermomètre numérique électronique. Placez tous les animaux à température ambiante pendant 4 heures.
- Anesthésier les rats avec de l’isoflurane (2 à 4 %) dans un bocal d’anesthésie refermable et observer jusqu’à ce que les rats soient profondément anesthésiés (absence de réponse au pincement des orteils). Euthanasier les rats par décapitation rapide à l’aide d’une guillotine.
- Prélever le sang du tronc de chaque rat (15 à 16 ml) à l’aide des pipettes apyrogènes dans des tubes apyrogènes pour obtenir du sérum, et prélever immédiatement des échantillons de sang (7 μl de chaque rat) à l’aide d’une pipette pour un examen microscopique.
- Mettez les tubes avec le sang dans un réfrigérateur pendant au moins 30 min pour permettre la coagulation. Centrifugez les tubes à 20 °C, 7 000 x g pendant 10 min, et retirez rapidement le sérum à l’aide d’une pipette. Aliquote le sérum obtenu de chaque rat dans des volumes de 50 μl et conservez-le à -20 °C jusqu’au dosage.
2. Procédure chirurgicale
- Coupez/coupez toute la fourrure de l’abdomen et du thorax du dessous de la carcasse avec des cisailles électriques. Placez la carcasse dans une armoire stérile et traitez la surface rasée de la carcasse avec de l’alcool à 70 %.
- Utilisez un scalpel stérile pour créer une incision médiane de l’abdomen. Retirez le foie, les ganglions lymphatiques mésentériques, la rate et l’intestin grêle de chaque rat à l’aide d’une pince à épiler stérile.
3. Analyse de la translocation bactérienne
- Placez chaque échantillon de foie, de ganglions lymphatiques mésentériques et de rate dans des tubes stériles pré-pesés et pesez. Calculez le poids de l’échantillon comme la différence entre le poids d’un tube contenant un échantillon et le poids d’un tube vide.
- Ajouter du PBS stérile dans le tube pour obtenir une dilution de 1:10 (poids par volume, p/v) de l’échantillon et homogénéiser chaque échantillon avec un homogénéisateur de tissu en verre stérile pour obtenir une suspension homogène.
- Effectuer des dilutions en série (10-1 à 10-4) de chaque échantillon dans du PBS stérile. Déposer 0,1 ml de toutes les dilutions de chaque tissu sur la surface des plaques de gélose MacConkey’s et de gélose au sang à 5 % et de gélose au sang Brucella avec de l’hémine (0,005 g/L) et de la vitamine K1 (0,01 g/L).
- Incuber des plaques de gélose au sang MacConkey et à 5 % en aérobie et des plaques de gélose au sang Brucella dans des conditions anaérobies à 37 °C.
- Comptez les colonies de bactéries aérobies après 24 heures et les colonies de bactéries anaérobies après 48 heures d’incubation à l’aide d’un compteur de colonies. Exprimez les résultats en nombre d’unités formant colonies (UFC) dans un gramme de tissu.
