Production et dépôt par aérosol de spores de Bacillus subtilis

Résumé

Source : Fuchs, F. M., et al. Étude des effets néfastes de la stérilisation au plasma à basse pression sur la survie des spores de Bacillus subtilis à l’aide de la microscopie à cellules vivantes. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre la production, la purification et le dépôt par aérosol de spores de Bacillus subtilis pour créer une monocouche uniforme, permettant des applications en aval telles que l’analyse microscopique de la germination, de la viabilité ou de la réponse au stress des spores.

Protocole

1. Production et purification de spores de Bacillus subtilis

1. Pour la production de spores, transférer une culture nocturne de 5 ml de la souche respective de B. subtilis , complétée par des antibiotiques appropriés, dans un milieu de sporulation Schaeffer liquide à double concentration de 200 ml (par litre de bouillon nutritif de 16 g, KCl (chlorure de potassium) 2 g, 0,5 g de MgSO₄*7 H₂O (sulfate de magnésium heptahydraté), 2 mL de 1 M de Ca(NO₃)₂ (nitrate de calcium), 2 mL 0,1 M MnCl₂ *• 4 H₂O (chlorure de manganèse tétrahydraté), 2 mL 1 mM FeSO₄ (sulfate ferreux), 2 mL 50 % (p/v) de glucose18) et cultivez-le avec une aération vigoureuse à 37 °C pendant 72 h ou jusqu’à ce que > 95 % de la culture ait sporulé. Les spores des souches suivantes sont utilisées : B. subtilis PY79 (type sauvage) B. subtilis PY79ΔrecA ::neo (déficient en protéine de réparation de l’ADN RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp ::cat (RecA fusionné avec la protéine fluorescente jaune [YFP]).
2. Récoltez les spores par centrifugation pendant 15 min à 3 000 x g dans des tubes de 50 mL et purifiez les échantillons par des étapes de lavage répétées (jusqu’à 15 fois) avec du H₂O distillé stérile et vérifiez la pureté et l’état de germination par microscopie à contraste de phase. S’assurer que les suspensions de spores sont constituées de spores en phase brillante (> 99 %) et qu’elles sont exemptes de cellules végétatives (bâtonnets), de spores germées (aspect noir/gris) et de débris cellulaires ; Sinon, d’autres expériences de microscopie peuvent être perturbées. Laver l’échantillon jusqu’à ce que la pureté souhaitée soit atteinte.
3. Déterminer le titre de spores en enfonçant 50 μL de dilutions en série 10 fois sur de la gélose LB (luria-bertani) (c’est-à-dire : utiliser un échantillon de 30 μL + 270 μL d’eau stérile pour une dilution de 1:10). Prenez 30 μL de la dilution particulière à 270 μL (_H2O pour une dilution de 1:100 et ainsi de suite) pour calculer les UFC (unités formant colonie) et incubez les plaques à 37 °C pendant la nuit. Après la détermination de l’UFC, ajuster l’échantillon à 10⁹ spores par mL en concentrant ou en diluant avec de l’eau stérile.

2. Préparation d’échantillons de spores de Bacillus subtilis déposées dans des aérosols

NOTE: L’accumulation et le chevauchement des spores peuvent entraîner des effets d’ombrage pendant le traitement, entraînant finalement une cinétique d’inactivation falsifiée. Pour minimiser ce problème, préparer des échantillons de spores par une technique de dépôt d’aérosol. En bref, contrôlez la buse à deux substances de haute précision à l’aide d’une minuterie électrique qui régule le débit de liquide de concert avec le débit de gaz vecteur sous pression (ici N₂). Dispersez l’échantillon liquide injecté à travers la sortie de la buse en utilisant le flux d’azote gazeux.

1. Placez un support d’échantillon sous la forme de lames microscopiques stérilisées (pour la cinétique de survie) ou de lamelles rondes de 25 mm (pour le suivi fluorescent des processus de réparation de l’ADN/cLSM ; microscopie confocale à balayage laser) à l’intérieur de l’unité de pulvérisation d’aérosol à commande électrique dans l’alignement de la buse. La concentration de spores utilisée doit correspondre à cent fois la concentration finale souhaitée.
2. Transférez 1 mL de la culture de spores à l’entrée du liquide de la buse et lancez le processus de pulvérisation de 0,1 s à une pression de 1,3 bar. La suspension de spores pulvérisée (1 x 10⁷) forme une fine pellicule sur la lame microscopique qui sèche rapidement en quelques secondes pour former une monocouche de spores uniformément répartie. Conservez les supports d’échantillons traités dans un récipient stérile à température ambiante.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Buse à deux substances (modèle 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, diamètre d’alésage de 0,8 mm
Luria Bertani Médium	Sigma Aldrich	Référence 70122-100G
Connecteurs de tubes	Festo	n/a	G 1/8
Glissières en verre	VWR	48300-026
Chambre cellulaire attofluor	Menzel, Fisher Réf.	3406816	d=25 mm, rond
Sulfate de magnésium heptahydraté	Sigma Aldrich	13152
Nitrate de calcium	Sigma Aldrich	202967
Chlorure de manganèse tétrahydraté	Sigma Aldrich	244589
Sulfate ferreux	AppliChem	13446-34-9
Glucose	Merck	215422
Chlorure de potassium	Sigma Aldrich	P9541-500G
Bouillon nutritif (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
Plaque à 96 puits	ThermoFisher	243656