Analyse de la viabilité de Microcystis aeruginosa à l’aide de la cytométrie en flux

Résumé

Source : Chapman, I. J., et al., Optimisation de la sonde moléculaire pour déterminer la mortalité cellulaire dans un organisme photosynthétique (Microcystis aeruginosa) à l’aide de la cytométrie en flux. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre la méthode permettant de distinguer les cellules vivantes et mortes de Microcystis aeruginosa en combinant le marquage par sonde fluorescente avec l’analyse cytométrique en flux de l’autofluorescence de la phycocyanine et du signal de la sonde.

Protocole

1. Optimisation de l’absorption des cellules de sonde moléculaire

1. Récoltez la moitié de la culture de M. aeruginosa à partir d’une phase exponentielle et utilisez-la comme témoin « vivant ».
   REMARQUE : Les échantillons dilués d’une culture à haute densité directement à une phase exponentielle peuvent affecter les résultats d’optimisation par le renouvellement des cellules mortes par rapport aux cultures inoculées à partir d’une phase initiale de décalage/induction.
2. Préparez l’autre moitié comme témoin « mort » en utilisant des méthodes telles que l’éthanol à 70 %, le chauffage des échantillons à 60 ^°C pendant 1 heure, le paraformaldéhyde ou le formaldéhyde à 4 % pendant 30 min. Vérifiez les variations dans le microenvironnement des échantillons (p. ex., pH).
   REMARQUE : Le témoin « mort » positif, tué thermiquement, chez M. aeruginosa se distingue d’un échantillon « vivant » par sa diminution des signaux de phycocyanine. L’induction de la mortalité par d’autres méthodes peut ne pas provoquer le même rendement et variera selon les espèces.
3. Configurez des échantillons mixtes en utilisant différents ratios d’échantillons « vivants » et « morts » (par exemple, 0 %, 25 %, 50 %, 100 %).
4. Désagrégez la formation des colonies par vortex ou sonication et vérifiez le pH.
5. Sélectionnez un laser de 488 nm ainsi que des détecteurs capables d’enregistrer la fluorescence des sondes d’acide nucléique vertes (canal de fluorescence 1 ou FL1, 530 ± 15 nm) et orange (canal de fluorescence 2 ou FL2, 585 ± 20 nm) et du laser de 640 nm pour enregistrer les signaux de phycocyanine à travers son détecteur respectif.
   REMARQUE : Lorsqu’elle est liée à l’ADN, la sonde d’acide nucléique verte a une longueur d’onde d’excitation de fluorescence approximative de 504 nm et des maxima d’émission de 523 nm, tandis que la sonde d’acide nucléique orange a une longueur d’onde d’excitation de 547 nm et des maxima d’émission de 570 nm. Un laser à semi-conducteurs argon ion de 488 nm peut être utilisé pour exciter les deux sondes moléculaires, cependant, un laser vert (jusqu’à 547 nm) produira une fluorescence orange plus élevée.
6. Comme point de départ, introduisez la sonde moléculaire à la concentration recommandée par le fabricant dans la culture à 50 % « vivante » et à 50 % « morte » et incubez dans l’obscurité.
7. Sélectionnez une nouvelle cellule de données, placez l’échantillon sous le port d’introduction d’échantillon (SIP) avec des seuils et des déclencheurs qui réduiront le bruit de fond (FSC-H ou hauteur de diffusion vers l’avant, 80 000).
8. Créez un graphique de densité avec les paramètres FSC-H et SSC-H (hauteur de diffusion latérale) et trois histogrammes. Un histogramme utilisant le canal de détection optique de la sonde moléculaire respectif (FL1 ou 2), l’un pour détecter les émissions de phycocyanine (canal de fluorescence 4 hauteur ou FL4-H), et l’autre, FSC-H, le tout sur une échelle logarithmique.
9. Incuber les échantillons de M. aeruginosa à l’aide des sondes d’acide nucléique dans l’obscurité pendant une période pouvant aller jusqu’à 60 minutes, en les enregistrant dans des cellules de données distinctes à différents moments (1, 5, 10, 15, 30 et 60 min).
   REMARQUE : Lors de l’ajustement de paramètres tels que le pH, vérifiez auprès des fabricants les réactions potentielles de certains produits chimiques (pour les sondes d’acides nucléiques testées, un tampon ne peut pas contenir de phosphates ou des niveaux élevés de cations monovalents ou divalents, car la liaison avec l’ADN sera réduite).
10. Appliquez une porte logicielle pour inclure uniquement l’histogramme FSC-H (320 000 - 1 500 000) pour la taille des cellules de l’organisme cible dans l’histogramme du canal de sonde de fluorescence respectif.
    REMARQUE : Les concentrations utilisées dans ce protocole étaient de 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 et 100 μM, qui peuvent être modifiées en augmentant ou en diminuant le volume de l’échantillon de M. aeruginosa ou de la solution mère initiale des sondes nucléiques.
11. Dans le canal de la sonde de fluorescence, appliquez une autre porte logicielle inclusive au pic le plus élevé de l’histogramme (FL1-H vert, 240 000 - 1 650 000, FL2-H orange, 30 000 - 165 000), puis placez cette fluorescence de sonde positive dans le graphique de densité.
12. Exécutez les étapes 3.1 à 3.11 avec 100 % d’échantillons « vivants », 100 % « morts » et tous les échantillons de cultures mixtes, en ajustant les concentrations de la sonde moléculaire (p. ex., x 0,1 à x 10) et/ou la température et le pH si nécessaire.
13. Comparez le nombre de signaux de fluorescence positifs de la sonde moléculaire à la densité cellulaire d’origine des cellules « mortes » (prélevée sur la moitié du FSC-H total ou une culture « morte » à 100 %) pour trouver le pourcentage total de cellules colorées avec les sondes d’acide nucléique.
14. Faites-le pour chaque période de temps à l’intérieur de chaque concentration afin de trouver le protocole optimal pour le pourcentage le plus élevé d’absorption de sonde nucléique cellulaire sans produire de coloration non spécifique (utilisez les moyennes dans une analyse de variance à un facteur, une ANOVA ou une analyse de variance à un facteur de Kruskal-Wallis si les données sont non paramétriques).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cyanobactéries Média	Sigma-Aldrich	Réf. C3061-500ML	BG-11 Solution concentrée d’eau douce (dilution x50)
Liquide de décontamination	BD Biosciences	653155	Exécution pendant 2 min lorsque les sorties sont supérieures à 12 événements par seconde en mode rapide ou à un débit de 66 μl/min. Suivi de 2 min de gaine H2O.
Cytomètre en flux	BD Biosciences	sur demande	BD Accuri C6
SYTOX Vert	Technologies de la vie	Réf. S7020	Coloration aux acides nucléiques – solution de 5 mM dans du DMSO
SYTOX Orange	Technologies de la vie	S11368	Coloration aux acides nucléiques – solution de 5 mM dans du DMSO