Évaluation de l’activité antimicrobienne des variants de la nisine à l’aide d’un essai de diffusion sur puits de gélose

Résumé

Source : Nickling, J. H., et.al. Peptides antimicrobiens produits par incorporation sélective par pression d’acides aminés non canoniques. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo fait la démonstration d’un test de diffusion de puits de gélose utilisé pour évaluer l’activité antimicrobienne des variantes de la nisine. Il montre comment Lactococcus lactis exprimant la peptidase membranaire NisP active les précurseurs de la nisine produits chez E. coli, entraînant des halos d’inhibition de la croissance. La taille de ces halos reflète la bioactivité de chaque variante de nisine.

Protocole

1. Test d’activité antimicrobienne

1. Préparation de plaques de gélose GM17 dans des conditions stériles
   1. Préparer une culture de nuit de la souche indicatrice L. lactis NZ9000 portant le plasmide pNG nisPT à 30 °C dans un bouillon M17 avec 1 % (p/v) de glucose (=GM17) et 5 μg/mL de chloramphénicol.
   2. Mesurer la DO₆₀₀, inoculer le milieu frais à la DO₆₀₀ = 0,1 et incuber jusqu’à la DO₆₀₀ = 0,4-0,6. Placez ensuite la fiole sur de la glace.
      NOTE: Chaque mesure OD₆₀₀ consommera du volume de culture. N’oubliez pas que pour chaque plaque de gélose d’essai, 1 mL de culture bactérienne sera nécessaire. Si nécessaire, augmentez le volume de culture liquide en conséquence.
   3. Pour 1,5 % d’agar, peser 4,5 g de gélose dans une bouteille en verre. Ajouter 300 ml de ddH₂O, mélanger et autoclave.
   4. Préparez 2x bouillon M17 (deux fois concentré) dans 300 mL de ddH₂O et autoclave.
   5. Mélanger 25 mL de bouillon 2x M17 contenant 10 μg/mL de chloramphénicol et 2 % de glucose avec 1 mL de préculture de L. lactis (4 % v/v).
   6. Ajouter 25 ml de gélose fondue à 1,5 % (fraîchement autoclavée ou chauffée au micro-ondes).
      NOTE: Avant cela, laissez la bouteille refroidir au toucher (environ 50 °C). Ceci est nécessaire car L. lactis est un organisme mésophile sensible aux températures élevées.
   7. Versez la solution dans une grande boîte de Pétri. Plaques sèches pendant 10-15 min.
   8. Stérilisez les extrémités d’une pipette Pasteur en verre à la flamme. Attendez qu’il refroidisse, puis utilisez l’extrémité large pour créer des trous dans la gélose GM17 solidifiée.
2. Préparation des échantillons
   1. Prélever 1 mL de cultures d’expression d’E. coli dans un tube de 1,5 mL étiqueté et centrifuger pendant 3 min à 7 000 x g. Aspirer le milieu restant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de Na-P (tampon de phosphate de sodium de 50 mM, pH 7,4 composé de dihydrogénophosphate de sodium 0,5 M et d’hydrogénophosphate disodique de 0,5 M).
   2. Sonicer les échantillons sur de la glace. Immergez l’extrémité de la sonde sonicatrice dans la suspension cellulaire. Réglez le sonicateur à une amplitude de 30 % avec une impulsion de 1 s allumée et 5 s éteinte pendant 3 min.
   3. Centrifugez le lysat cellulaire pendant 10 min à 13 000 x g pour granuler les débris cellulaires. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de réaction sur de la glace.
   4. Diluer et normaliser les surnageants de l’extrait cellulaire à 1 mL OD₆₀₀ = 0,6, par rapport à la densité cellulaire récoltée, avec du Na-P.
3. Test d’activité
   1. Ajouter 40 μL de chaque échantillon normalisé dans un trou de la plaque de gélose indicatrice (figure 1). Utiliser le chloramphénicol à 400 μg/mL comme composé de contrôle antibactérien. Utilisez le tampon d’élution comme témoin négatif. Attendez que tous les échantillons soient diffusés dans la gélose. Incuber la plaque toute la nuit à 30 °C.
   2. Prenez des photos des plaques de gélose à l’aide d’un scanner à plat ou d’un appareil photo numérique. La taille des halos d’inhibition de croissance peut être mesurée à la main ou à l’aide d’ImageJ.

Résultats

Graphique 1. Dosage de l’activité antimicrobienne de lysats cellulaires contenant des variants de nisine produits via SPI avec des analogues de proline. Comparaison des variants de la nisine avec des éch...

Matériaux