Préparation d’expectorations artificielles pour imiter ex vivo les expectorations pulmonaires de la mucoviscidose

Résumé

Source : Vieira, J., et al. Conception et développement d’un modèle pour étudier l’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome des voies respiratoires de la fibrose kystique. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo montre la préparation d’un milieu d’expectoration artificiel qui imite la viscosité, la composition nutritionnelle et le pH des expectorations pulmonaires de la fibrose kystique. Le milieu résultant fournit une plate-forme physiologiquement pertinente pour les études ex vivo.

Protocole

1. Préparation du milieu d’expectoration artificielle

NOTE: Les quantités indiquées ici sont pour la production de 1 L de milieu d’expectoration artificiel final, et supposent les réactifs spécifiques énumérés dans le tableau des matériaux. Les nombres doivent être ajustés pour d’autres volumes ou pour l’utilisation de réactifs différents afin d’assurer le même produit final. Voir le tableau 1 pour les concentrations cibles.

1. Mélange chimique d’expectorations artificielles (ASCM)
   NOTE: L’ASCM représente 25 % du volume final du support. Il est stable à la conservation et peut être préparé en vrac ou à l’avance. S’il est préparé pour une utilisation ultérieure, autoclavez le mélange chimique et conservez-le en toute sécurité à température ambiante.
   1. Mélangez les solutions mères de produits chimiques constitutifs.
      1. Préparez 1 M de bouillon NaCl : Ajouter 58,44 g de NaCl par litre d’eau stérile.
      2. Préparez 1 M de bouillon KCl : Ajouter 74,55 g de KCl par litre d’eau stérile.
      3. Préparer 1 M de MgSO₄ : Ajouter 246,47 g de MgSO₄·7H₂O par litre d’eau stérile, ou 120,37 g de MgSO₄ anhydre par litre d’eau stérile.
      4. Préparez 1 M de stock de glucose : Ajouter 180,16 g de glucose par litre d’eau stérile.
   2. Stérilisez en autoclave les solutions mères de produits chimiques, ainsi qu’un flacon vide de 250 ml. Effectuez les étapes d’autoclave à des valeurs standard d’au moins 121 °C et 15 PSI pendant 30 min.
   3. Ajouter 80,59 mL d’eau stérile dans la bouteille vide de 250 mL.
   4. Ajouter 152,30 mL de 1 M de NaCl au mélange.
   5. Ajouter 15,8 mL de 1 M de KCl au mélange.
   6. Ajouter 610 μL de 1 M de pâte MgSO₄ au mélange.
   7. Ajouter 700 μL de stock de glucose 1 M au mélange.
2. Mélange artificiel de mucine d’expectoration (ASMM)
   NOTE: L’ASMM représente 50 % du volume final du support. Assurez-vous qu’il est préparé le même jour que le lot moyen final.
   1. Ajouter 450 ml d’eau stérile dans une bouteille vide de 1 L.
   2. Ajoutez 50 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 10x dans la bouteille.
   3. Ajoutez une barre d’agitation magnétique jetable à la bouteille.
   4. Autoclavez la bouteille contenant le PBS et le barreau.
   5. Mesurez 10 g de poudre de mucine et ajoutez-la au PBS.
   6. Agitez vigoureusement le flacon pour un mélange préliminaire.
   7. Placez la bouteille sur une plaque chauffante à l’aide d’un agitateur magnétique. Réglez le feu à moyen-vif, en ciblant 50 °C et la vitesse d’agitation à 1100 tr/min. Augmentez progressivement la vitesse afin que la barre ne s’envole pas de l’aimant.
      1. Laisser chauffer et remuer pendant 15 min.
      2. Ramassez la bouteille avec des gants résistants à la chaleur. Observez pour vérifier si la poudre de mucine se dépose hors de la solution.
      3. Si la poudre de mucine n’est pas complètement dissoute, remettez le flacon dans le feu pendant 5 minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous.
   8. Laisser refroidir le mélange de mucine à température ambiante.
3. Mélange biologique d’expectorations artificielles (ASBM)
   NOTE: L’ASBM représente 25 % du volume final du médium. Préparez-le le même jour que le dernier lot moyen et, contrairement aux autres mélanges, n’exposez pas ses composants à la chaleur.
   1. Décongelez le bouillon de vitamines 100x dans un réfrigérateur à 4 °C ou sur de la glace. ​
      NOTE: Prérépartissez le bouillon de vitamines dans des aliquotes de 10 ml pour minimiser le nombre de cycles de congélation et de décongélation.
   2. Ajouter 124,24 mL d’eau stérile dans la bouteille vide de 250 mL autoclavée.
   3. Ajouter 25,76 ml de 50 x le bouillon d’acides aminés essentiels au mélange.
   4. Ajouter 80,14 ml de 100 acides aminés non essentiels au mélange.
   5. Ajouter 10 ml de bouillon de vitamines 100x (décongelé) au mélange.
   6. Ajouter 1 mL de stock de 1000x oligo-métaux au mélange.
   7. Ajouter 8,33 ml d’émulsion de jaune d’œuf à 30 % au mélange.
   8. Ajouter 400 μL de stock de ferritine de 10 g/L au mélange.
   9. Mélangez bien la solution en agitant manuellement.
4. Milieu d’expectoration artificielle (ASM)
   1. Ajouter 250 ml d’ASCM à la bouteille de 1 L contenant de l’ASMM.
   2. Ajouter 250 ml d’ASBM dans la bouteille moyenne.
   3. Titrez le milieu avec un tampon MOPS de base (1 M) pour atteindre un pH de 6,3 sur un papier à pH étroit. Avant le titrage, le mélange de milieu sera trop acide.
   4. Réfrigérez le milieu d’expectoration artificiel obtenu à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la filtration.
   5. Pour commencer le processus de filtration, transférez 200 mL de milieu d’expectoration artificielle non filtré dans un système de filtration sous vide avec un filtre à pores de 0,22 μm.
   6. Connectez le système de filtration à la pompe à vide, allumez la pompe à vide, réglez-la sur 70 mbar, puis placez la chambre sur un agitateur orbital à 90 tr/min dans une chambre froide à 4 °C.
      1. Complétez avec 150 ml supplémentaires du fluide, au fur et à mesure qu’une quantité appréciable est filtrée. Il faut 1 à 2 jours pour filtrer complètement 1 L de milieu.
      2. Répétez l’opération avec des chambres supplémentaires jusqu’à ce que tout le média soit filtré.
         NOTE: Essayez de ne pas filtrer plus de 350 ml du milieu à travers le même filtre de 0,22 μm, car la mucine bouchera le filtre avec le temps.
   7. Réfrigérer le milieu filtré des expectorations artificielles à 4 °C jusqu’au moment de l’utiliser. Utilisez ASM dans le mois suivant la préparation pour de meilleurs résultats.

Tableau 1 : Recette du milieu d’expectoration artificiel dérivée de la revue de la littérature (colonne 1) Réactifs et valeurs clés dans la formulation d’un milieu d’expectoration artificiel. (Colonnes 2-7) Comparaison des recettes de la littérature existante. (Colonnes 8-9).

Colonne 1		Colonne 2	Colonne 3	Colonne 4	Colonne 5	Colonne 6	Colonne 7	Colonne 8	Colonne 9
Valeur		Comstock	Kirchner	Sriramulu	Palmer	Flynn	Gallagher	Lai	Source
Mucine		2 % p/v	0,5 % p/v	0,5 % p/v	-	1 % p/v	2 % p/v	1 % p/v	Flynn
Chlorure de sodium		85,5 millions d’euros	85,5 millions d’euros	85,5 millions d’euros	66,6 millions d’euros	89,8 millions d’euros	85,5 millions d’euros	152,3 millions d’euros	Lapierre
Chlorure de potassium		29,5 millions d’euros	29,5 millions d’euros	29,5 millions d’euros	15,8 millions d’euros	-	2,95 millions d’euros	15,8 millions d’euros	Palmer
Sulfate de magnésium		-	-	-	0,6 million de kilomètres	1 million d’euros	1 million d’euros	0,61 million d’euros	Palmer
Sulfate de fer		-	-	-	0,0036 million d’années	-	-	-	-
Chlorure d’ammonium		-	-	-	2,3 millions d’euros	60 millions de mètres	-	-	-
Phosphate monopotassique		-	-	-	2,5 millions d’euros	60 millions de mètres	-	-	-
Glucose		-	-	-	3,2 millions d’euros	13 millions d’années	40 millions d’euros	0,7 million d’euros	Sambeek
Lactate		-	-	-	9 millions d’euros	-	-	-	-
Acides aminés essentiels		14,45 fois	0,25 g/L	0,25 g/L	Par acide	0,5 fois	0,375 fois	1,29x	Palmer
Acides aminés non essentiels		28,9 fois	0,25 g/L	0,25 g/L	Par acide	0,25x	0,5 fois	8,01 fois	Palmer
Vitamine		-	-	-	-	-	1x	1x	Gallagher
Métaux traces		-	-	-	-	1x	1x	1x	Flynn
Jaune d’œuf		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	Kirchner
Ferritine		0,0003 g/L	-	-	-	-	0,0004 g/L	0,0004 g/L	Gallagher
ADN de spermatozoïde de saumon		1,4 g/L	4 g/L	4 g/L	-	-	1,4 g/L	-	-
DPTA		-	-	0,0059 g/L	-	-	-	-	-
pH		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	Lapierre
Stockage		0	4°	-	-	4°	4°	4°	Kirchner
Stérilisation		Autoclave	Filtre	Autoclave	-	Autoclave	Autoclave	Filtre	Kirchner

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vitamines BME (100x) Solution	MilliporeSigma	Réf. B6891	Solution concentrée de vitamines complémentaires.
Sertisseuse, 30 mm	DWK Sciences de la vie	224307	Sertisseuse pour fixer des joints en aluminium sur des flacons de sérum.
D-(+)-glucose	MilliporeSigma	Réf. G7021	Poudre de glucose solide (isomère dextrogyre).
Pompe à membrane ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Pompe à vide pour la filtration sous vide.
Émulsion de jaune d’œuf	HiMedia	FD045	Émulsion stérile de 30 % de jaune d’œuf dans une solution saline.
Ferritine cationisée de la rate du cheval	MilliporeSigma	F7879	Solution de ferritine (protéine de stockage du fer).
Brûleur Bunsen de sécurité FIREBOY plus	Integra Biosciences	144000	Bec Bunsen avec interface utilisateur et fonctions de sécurité.
Papier pH Hydrion (1,0 à 14,0)	Laboratoire Micro Essentiel	94	Papier de test de pH pour la plage de 1,0 à 14,0.
Papier pH Hydrion (4,0 à 9,0)	Laboratoire Micro Essentiel	55	Papier de test de pH pour la plage de 4,0 à 9,0.
Papier pH Hydrion (6,0 à 8,0)	Laboratoire Micro Essentiel	345	Papier de test de pH pour la plage de 6,0 à 8,0.
Dispositif de sécurité hypodermique Needle-Pro EDGE, 18 g	Smiths Medical	401815	Aiguilles de 18 g avec capuchons de sécurité.
Manomètre en ligne	MilliporeSigma	20469	Manomètre de gaz pour surveiller la pression de la bouteille.
Innova 42 Agitateur incubé	Eppendorf	2231000756	Combinaison incubateur/agitateur orbital.
Seringue Luer-Lok avec aiguille attachée	Becton Dickinson	309580	Seringue de 3 ml et aiguille de 18 g.
Assortiment de valves Luer	Instruments de précision mondiaux	14011	Vannes pour tubes d’écoulement de gaz.
Agitateur orbital LSE	ThermoFisher Scientific	Référence 6780-NP	Agitateur orbital pour agiter le média pendant la filtration.
Sulfate de magnésium heptahydraté	MilliporeSigma	M2773	Sel d’Epsom solide (sulfate de magnésium heptahydraté).
Régulateur d’air médical à un étage avec débitmètre	Entreprises de l’Ouest	M1-346-15FM	Régulateur de débit d’air avec compteur de 15 L/min.
Solution d’acides aminés MEM (50x)	MilliporeSigma	Référence M5550	Solution concentrée d’acides aminés essentiels.
Solution d’acides aminés non essentiels MEM (100x)	MilliporeSigma	Référence M7145	Solution concentrée d’acides aminés non essentiels.
Filtre Millex-GP, 0,22 μm	MilliporeSigma	SLMP25SS	Filtre à seringue stérile à membrane polyéthersulfone de 0,22 μm.
Milli-Q Académique	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Système de filtration d’eau stérile Milli-Q.
Moniteur d’oxygène MiniOX 3000	MSA	814365	Moniteur de débit de gaz et de pourcentage d’oxygène.
Tampon MOPS (1 m, pH 9,0)	Boston BioProducts	BBM-90	Tampon MOPS pour ajuster le pH du support.
Mucine d’estomac porcin	MilliporeSigma	M2378	Mucine (protéine gélifiante glycosylée) en poudre.
Chlorure de potassium	MilliporeSigma	P9541	Sel solide de chlorure de potassium.
Barres d’agitation jetables en PTFE	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Barres d’agitation magnétiques jetables.
Ruban téflon d’étanchéité à filetage PTFE	VWR	470042-938	Ruban téflon pour le renforcement des connexions du système de gaz.
Cartouche de purification Q-Gard 2	MilliporeSigma	QGARD00D2	Cartouche de purification pour système Milli-Q.
Bouteilles de stockage multimédia réutilisables	ThermoFisher Scientific	Référence 06-423A	Flacons pour le mélange et le stockage des milieux de culture.
Bouchon en caoutchouc, 30 mm, bromobutyle gris	DWK Sciences de la vie	224100-331	Bouchons en caoutchouc pour flacons de sérum.
Flacon de sérum avec graduations moulées, 500 mL	DWK Sciences de la vie	223952	Flacons de sérum en verre pour une culture scellée.
Kit d’extension de petit alésage	Braun Médical	471960	Rallonge de tube avec connecteurs Luer Lock.
Chlorure de sodium	MilliporeSigma	S3014	Sel solide de chlorure de sodium.
Mélange de métaux traces, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Solution concentrée de métaux traces physiologiques.
Joint en aluminium non doublé, 30 mm	DWK Sciences de la vie	224187-01	Joints en aluminium sertis sur le dessus des bouchons en caoutchouc.