Quantification des unités formant des colonies de bactéries associées à l’intestin chez la drosophile

Résumé

Source : Dodge, R., et al. Comptage rapide d’unités de formation de colonies sous forme de plaque à 96 puits appliquée au microbiome de la drosophile . J. Vis. Exp. (2023)

Cette vidéo démontre la quantification des unités formant des colonies (UFC) de bactéries associées à l’intestin chez les mouches drosophiles à l’aide d’une approche de dilution et de placage en série. Des échantillons de mouches homogénéisés contenant des bactéries intestinales sont dilués en série, placés sur de la gélose et incubés pour permettre la croissance des colonies. Les images des plaques sont ensuite analysées à l’aide d’un logiciel pour aligner, segmenter et compter les colonies à chaque endroit, ce qui permet une quantification précise de l’UFC.

Protocole

1. Homogénéisation des mouches individuellement dans une plaque PCR de 96 puits

1. Préparez les plaques de batteur de perles à l’avance.
   1. Versez des billes de verre de 0,5 μm (voir tableau des matériaux) sur le plateau de mesure des billes. Étalez les perles sur le plateau de manière à ce que tous les puits soient pleins et de niveau, puis brossez les perles en excès dans un tube conique pour les récupérer.
   2. Placez une plaque d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) semi-jupe (voir le tableau des matériaux) à l’envers sur le plateau doseur et alignez-la avec les puits en l’insérant dans l’indentation du plateau. Ensuite, retournez-le rapidement pour transférer les perles.
   3. Retirez l’excédent de billes de la surface de la plaque PCR et couvrez-la de papier d’aluminium. Inspectez la plaque PCR pour vous assurer que tous les puits contiennent des billes. Utilisez une pelle pesée si nécessaire pour ajouter des billes à un seul puits. Si l’électricité statique fait coller des billes sur les surfaces de la plaque, essuyez ou vaporisez le dos du plateau de mesure et de la plaque PCR avec de l’éthanol à 70 %.
   4. Couvrir de papier d’aluminium. De nombreuses plaques peuvent être préparées de cette manière, puis autoclavées et stockées pour une utilisation ultérieure. Lorsqu’il est prêt à l’emploi, ajoutez 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans chaque puits à l’aide de la pipette à 96 canaux (voir la table des matériaux).
2. Stérilisez en surface les mouches colonisées par des microbes avec de l’éthanol à 70 % avant l’homogénéisation.
   1. Anesthésie les mouches avec 100 % de CO₂ pendant 5 s. Transférez les mouches anesthésiées du flacon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’un petit entonnoir (figure 1A-2). Dans cette étude, 25 mouches ont généralement été ajoutées par tube.
   2. Vaporisez immédiatement ~1 mL d’éthanol à 70 % dans le tube, fermez le tube et mélangez par inversion pendant 10 s. Ensuite, aspirez l’éthanol avec une pipette P1000 en faisant attention de ne pas aspirer de mouches. Répétez l’opération avec de l’éthanol, puis deux fois avec du PBS stérile (Figure 1A-3).
3. Après le dernier lavage PBS, fermez le tube et, avec le capuchon vers le bas, tapotez-le fort plusieurs fois sur le banc pour que les mouches entrent dans le bouchon.
4. Ouvrez le tube et distribuez les mouches dans les puits à l’aide d’une pince (figure 1A-4). Placez une mouche dans chaque puits (figure 1A-5). Gardez la plaque sur de la glace pendant le chargement pour garder les mouches anesthésiées.
5. Scellez la plaque à l’aide d’une feuille de thermoscellage Thermal Bond (voir tableau des matériaux).
   1. Tout d’abord, retirez toutes les billes errantes qui se trouvent à proximité des puits, car elles peuvent provoquer des fuites dans le joint en aluminium. Assurez-vous que le côté émoussé de la feuille est orienté vers le bas sur la plaque et le côté brillant vers le haut vers la thermoscelleuse. Appuyez fermement sur la thermosoudeuse (voir le tableau des matériaux) pendant 5 s (Figure 1A-6). Brunir avec l’applicateur à main (voir le tableau des matériaux) pour fixer la feuille.
      REMARQUE : Une mauvaise étanchéité est une cause de perte d’échantillon.
6. Fixez la plaque dans le secoueur de plaques. Homogénéiser pendant 5 min (Figure 1A-7). Faites pivoter la plaque de talon pendant 30 s dans une mini-plaque (voir tableau des matériaux) à 350 x g pour éliminer le liquide de la feuille d’étanchéité.
7. Retirez le papier d’aluminium tout en tenant la plaque afin de ne pas éclabousser les gouttelettes d’homogénat de mouches hors des puits.

2. Dilution en série de l’homogénat de mouches et spotting sur des plaques CFU

1. Placez quatre plaques de croissance de gélose rectangulaires de Man, Rogosa et Sharpe (MRS) (voir la Table des matières) dans l’enceinte de biosécurité et retirez leurs couvercles. Dans ce protocole, la gélose MRS a été utilisée pour la croissance de L. plantarum. Laissez sécher ces plaques pendant au moins 10 min (20 min si elles sont fraîchement versées ou froides du stockage).
   REMARQUE : Si les plaques sont mouillées, les gouttelettes de la plaque de 96 puits s’écouleront ensemble et ruineront le comptage.
2. Préparez trois plaques de dilution en ajoutant 100 μL de PBS dans chaque puits d’une plaque stérile à 96 puits à l’aide d’une pipette à 96 canaux. Chargez un rack de pointes P20 sur le pipeteur à 96 canaux.
3. Effectuer une dilution de 1:10 en aspirant 11,1 μL d’homogénat à partir de la plaque d’échantillon préparée à la section 1 (figure 1A-8). Assurez-vous de puiser au milieu des puits plutôt qu’au fond des puits car l’homogénat de mouches et les billes de verre obstrueront les pipettes. Les billes coulent et les particules de mouche flottent, laissant la couche intermédiaire presque claire.
4. Versez les 11,1 μL dans la première plaque de dilution, qui contient déjà 100 μL de PBS stérile par puits. Maintenez la plaque de dilution sur l’agitateur de plaques pendant 10 s à 600 tours par minute (tr/min). Mélangez à nouveau en pipetant de haut en bas pendant cinq cycles. Transférez 11,1 μL de la première plaque de dilution à la deuxième plaque de dilution et répétez les étapes de mélange pour les deux plaques de dilution suivantes.
5. Effectuez le placage en série de dilution comme décrit ci-dessous.
   1. Récupérez les plaques de croissance de l’enceinte de biosécurité.
   2. En commençant par la plaque la plus diluée, prélever 2 μL de chaque puits sur les plaques de gélose à l’aide de la pipette à 96 puits (figure 1A-9).
      1. Abaissez lentement la tête de la pipette sur la plaque, en prenant soin de ne pas poignarder l’agar. Examinez attentivement la plaque et assurez-vous que tous les points ont été distribués ; sinon, ajoutez manuellement 2 μL à la position appropriée. Vérifiez que les taches de liquide pénètrent rapidement dans la gélose et ne coulent pas ensemble.
      2. Si les taches se rejoignent, séchez un nouvel ensemble de plaques de gélose fraîche pendant une période plus longue et refaites les taches. S’il existe plusieurs types de plaques (p. ex., différents milieux ou avec des antibiotiques), repérez-les également. Versez toute solution restante dans la plaque de dilution et passez à la concentration supérieure suivante.
         REMARQUE : Lorsque vous repérez des dilutions, mélangez cinq fois la dilution suivante pour vous assurer que le contenu des pointes de pipette est débarrassé de la dilution précédente. Les plaques de dilution peuvent être stockées pendant >8 h à 4 °C sans affecter le nombre de colonies.
6. Répétez le processus de placage comme décrit à l’étape 2.5 pour les plaques de dilution restantes, en progressant de la plus diluée à la plus concentrée jusqu’à la plaque avec l’homogénat d’origine.
7. Lorsque tout le liquide a été absorbé dans la gélose, retournez les plaques et placez-les dans l’incubateur (Figure 1A-10). Pour Lactiplantibacillus et Acetobacter de Drosophile, la température optimale est de 30 °C sur les milieux MRS. Incuber jusqu’à ce que les colonies aient atteint leur taille optimale : les colonies sont assez grandes pour être clairement visibles, mais pas trop grandes pour qu’elles fusionnent ou interfèrent avec la croissance les unes des autres (voir les résultats représentatifs pour la quantification de la taille optimale).
   REMARQUE : Les conditions de croissance optimales dépendent de la souche et doivent être déterminées empiriquement. Pour Lactiplantibacillus de Drosophile, le temps optimal d’incubation est de 26 h à 30 h sur gélose MRS. Pour Acetobacter de Drosophila, le temps optimal d’incubation est de 30 h à 48 h sur MRS, selon la souche.
8. Après l’incubation, conservez les plaques à 4 °C si nécessaire jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être comptées.

3. Quantification des unités formant colonies (UFC)

1. Quantifiez les UFC en photographiant les plaques, puis en comptant les colonies à l’aide d’un logiciel automatisé, comme indiqué ci-dessous. Si les plaques ont été stockées à 4 °C, laissez-les d’abord atteindre la température ambiante afin qu’il n’y ait pas de condensation sur les plaques, ce qui produit de l’éblouissement.
2. Organisez les plaques dans un ordre logique et gardez-les dans cet ordre pendant la photographie - cela facilite le nom des fichiers. Orientez toutes les plaques de manière à ce que A1 se trouve dans le coin supérieur gauche pour toutes les plaques. Il est recommandé d’étiqueter le coin A1 avec un identifiant unique pour éviter toute confusion des photos. Empilez chaque série de dilution dans l’ordre.
3. Retirez le couvercle de la plaque et placez la plaque sur la platine avec A1 orienté dans le bon coin. La boîte photo à plaque est optimisée pour la photographie de ces plaques de plateau et comprend des options d’éclairage et de filtre pour imager les colonies fluorescentes.
4. Imagez les plaques. Utilisez l’appareil photo (voir le tableau des matériaux) avec des réglages manuels pour obtenir un niveau d’exposition cohérent entre les plaques. Un réglage de longue focale est recommandé pour minimiser la distorsion de perspective. Capturez la photo à l’aide d’un obturateur à distance pour minimiser le flou de bougé de l’appareil photo.
5. Transférez les images sur un ordinateur et renommez-les, y compris le nom de l’expérience, le type de support, le facteur de dilution et tout autre détail pertinent. Certains systèmes d’exploitation (voir la Table des matériaux) disposent d’une fonction utile de renommage par lots dans le Finder en cliquant avec le bouton droit de la souris sur une sélection de fichiers.

4. Comptage automatisé des colonies à l’aide de la suite Count-On-It

1. Recadrez les images à l’aide du plugin Croptacular fourni pour ImageJ. Ce plugin permet de diviser l’image en un tableau ordonné de sous-régions (par exemple, 8 x 12 pour une plaque à 96 puits). Les sous-régions seront comptées individuellement.
   1. Organisez les images à traiter pour la quantification dans un dossier. Choisissez des noms de fichiers qui distinguent les plaques, car ces noms de fichiers deviennent des titres de colonnes pour chaque ensemble de comptes. Dans ce dossier, créez des sous-dossiers nommés « cropped » et « receipts ».
   2. Lancez Croptacular et cliquez sur OK pour commencer le recadrage.
      REMARQUE : Les paramètres par défaut sont affichés et sont généralement suffisants. En fonction de la résolution de l’image, de l’éclairage, de la taille du spot, etc., il peut être utile d’ajuster les paramètres de base.
   3. Si l’image est déjà droite, appuyez simplement sur Espace. Sinon, redressez l’image en traçant une ligne le long d’un bord qui doit devenir horizontal. Retracez la ligne autant de fois que nécessaire si l’image n’apparaît toujours pas redressée.
   4. Ensuite, tracez une case de délimitation de la zone pour laquelle le comptage doit être effectué. Ajustez la taille et la proportion jusqu’à ce que toutes les taches soient à l’intérieur de leurs cellules. Faites glisser le curseur à l’extérieur de la zone de délimitation pour actualiser la grille. Lorsque la grille semble bonne, appuyez sur Espace.
   5. Assurez-vous que l’image suivante pivote automatiquement dans le même angle que la première ; Le plugin suppose que toutes les photos sont alignées de la même manière. Si c’est exact, appuyez sur Espace pour continuer. Sinon, redressez l’image comme précédemment. La grille rappelle également la même position que l’image précédente ; ajustez si nécessaire, puis appuyez sur Espace.
2. Énumérez les colonies sur les plaques à l’aide du plugin Count-On-It : Gridiron fourni pour ImageJ.
   1. Lancez Count-On-It > Gridiron. Utilisez les mêmes paramètres de grille qu’avec Croptacular. Les utilisateurs peuvent regrouper un dossier entier, analyser une seule image ou partir de l’image actuelle.
   2. Définissez le seuil en fonction d’une valeur d’intensité de pixel supérieure et inférieure. Rendez le seuil aussi strict que possible tout en sélectionnant toutes les colonies. Idéalement, il y aura un peu d’espace entre les colonies sélectionnées, mais le logiciel est capable de segmenter les blobs dans une certaine mesure. Cliquez sur OK dans la boîte de dialogue « Action requise » lorsque le seuil est satisfaisant.
   3. Pour inspecter les résultats, zoomez et regardez de plus près le nombre de colonies. En cliquant sur Annuler, le plugin sera abandonné. Cliquez sur OK pour continuer.
   4. Sur la première image, assurez-vous que l’option est donnée pour continuer ou revenir au menu de configuration, par exemple, pour modifier la taille minimale de la colonie. Pour poursuivre le traitement par lots, cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez un dossier pour conserver le tableau des reçus et des résultats. Utilisez le dossier « reçus » ou créez un nouveau dossier.
   5. Après la première image, les images suivantes auront par défaut le même seuil que les paramètres précédents. Cliquez sur OK pour utiliser ces paramètres ou les ajuster. Si les photos sont cohérentes et que le réglage est précis, cliquez sur OK dans la boîte de dialogue « Action requise ».
      REMARQUE : Une fois que toutes les images du lot sont terminées, le tableau des résultats est automatiquement enregistré dans le même dossier que les reçus.
   6. Examinez les reçus de comptage produits par le logiciel et corrigez manuellement les erreurs de comptage. Le plug-in ImageJ est statistiquement précis, mais des erreurs se produisent. Corrigez les reçus pour examiner les valeurs aberrantes et identifier les erreurs de comptage. Le logiciel enregistre les données CFU sous forme de fichier .csv dans le même dossier que les reçus.
3. Analysez les données à l’aide du logiciel préféré de l’utilisateur.

Résultats

Figure 1 : L’essai de colonisation mesure les UFC chez des centaines de mouches individuelles à l’aide d’une plaque à 96 puits. (A) Vue d’ensemble illustrée de l’essai de colonisation et de la méthode de quantification à haut ...

Matériaux