Traitement de bactéries avec des exsudats racinaires de plantes pour imiter in vitro les interactions plantes-microbes

Résumé

Source : Yi, Y., et al. Interaction plante-microbe : réponse transcriptionnelle de Bacillus mycoides aux exsudats de racine de pomme de terre. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre la préparation et le traitement de cultures de Bacillus mycoides pour étudier les interactions plantes-microbes. Il décrit les étapes allant de la strie d’une culture mère et de son incubation dans un milieu liquide à l’exposition des bactéries aux exsudats racinaires des plantes sous agitation. Le processus aboutit à la récolte et à la congélation rapide des cellules bactériennes pour l’analyse ultérieure des changements d’expression génique induits par les exsudats.

Protocole

1. Croissance des bactéries

1. Trempez une souche de B. mycoides à partir d’un stock de glycérol à -80 °C sur une plaque de gélose Luria-Bertani (LB) et incubez la plaque à 30 °C pendant la nuit.

2. Inoculez un milieu liquide LB avec une seule colonie de la plaque et cultivez la culture dans un incubateur à agitation à 200 tr/min pendant la nuit à
30 °C.

2. Traitement et échantillonnage des bactéries

1. Pour comparer la courbe de croissance des bactéries traitées avec des exsudats racinaires à un témoin négatif, préparez une série de flacons contenant 50 mL de milieu liquide LB. Ajouter 0,5 mL de culture bactérienne de nuit dans tous les flacons, et ajouter 0 %, 5 %, 10 % ou 15 % (v/v) d’exsudat racinaire ou de l’eau déminéralisée stérile dans le milieu, respectivement.

2. Utilisez une culture avec de l’eau déminéralisée au lieu d’exsudats racinaires comme contrôle. Mesurez la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) toutes les 1 h par la suite. Générez une courbe de croissance en traçant les valeurs OD₆₀₀ en fonction du temps.

3. Diluer une culture de B. mycoides pendant la nuit avec 90 mL de milieu LB préchauffé jusqu’à une DO_{initiale de 600} de ~ 0,05 dans une fiole de 300 mL. Ajouter 10 mL d’exsudats racinaires à la culture et l’incuber à 30 °C pendant 1 h.

4. Utilisez un traitement à l’eau désionisée stérile de 10 mL comme témoin. Prélever les cellules de la culture par centrifugation à 9 000 x g pendant 2 min à 4 °C. Jeter le surnageant et congeler immédiatement la pastille dans de l’azote liquide, puis la stocker à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Hypochlorite de sodium	Sigma	N° CAS : 7681-52-9	10-15 % de chlore actif
Bouillon Luria-Bertani (LB)
Incubateur	Scientifique du Nouveau-Brunswick	Innova 4000
Spectrophotomètre	Thermo Fisher Scientific	Genesys 20
Azote liquide
Perles de verre	Sigma	Référence G8893	0,5 μm
Tube de 2,0 ml avec bouchon à vis			Sans RNase
Tube Eppendorf de 1,5 ml et 2,0 ml			Sans RNase
Centrifugeuse	Eppendorf	5430