Essai de croissance bactérienne limitée aux métaux pour étudier le rôle des gènes sensibles aux métaux

Résumé

Source : Maurakis, S., et al. Croissance limitée en métaux de Neisseria gonorrhoeae pour la caractérisation des gènes sensibles aux métaux et l’acquisition de métaux à partir de ligands hôtes. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo présente un test de croissance bactérienne limité aux métaux pour étudier le rôle des gènes sensibles aux métaux. Les bactéries de type sauvage et mutantes cultivées dans un milieu appauvri en métal sont incubées avec des ligands métalliques, et leur croissance est surveillée à l’aide d’un lecteur de plaques. Dans des conditions appauvries en métal, les bactéries de type sauvage expriment un récepteur de surface qui permet l’absorption et la croissance des métaux, tandis que le mutant n’a pas ce récepteur, ce qui entraîne une croissance restreinte.

Protocole

1. Préparation de solutions mères de milieu défini (CDM) traitées à Chelex

1. Solution mère I
   1. Combiner du chlorure de sodium ou NaCl (233,8 g), du sulfate de potassium ou_K2SO₄ (40,0 g), du chlorure d’ammonium ou NH₄Cl (8,8 g), de l’hydrogénophosphate dipotassique ou K₂HPO₄ (13,9 g) et du dihydrogénophosphate monopotassique ou KH₂PO₄ (10,9 g) dans de l’eau désionisée jusqu’à un volume final de 1 L.
   2. Stériliser la solution par filtre et aliquote dans des tubes coniques de 50 ml.
   3. Conserver à -20 °C.
2. Solution mère II
   1. Combinez l’acide chlorhydrique de thiamine ou HCl (0,2 g), le pyrophosphate de thiamine Cl (0,05 g), le pantothénate de calcium (0,19 g) et la biotine (0,3 g) dans de l’éthanol à 50 % (vol/vol) jusqu’à un volume final de 1 L.
   2. Humidifier dans des tubes coniques de 50 mL et conserver à -20 °C.
3. Solution mère III
   1. Combinez le L-aspartate (4,0 g), le L-glutamate (10,4 g), la L-arginine (1,2 g), la glycine (0,2 g), la L-sérine (0,4 g), la L-leucine (0,72 g), la L-isoleucine (0,24 g), la L-valine (0,48 g), la L-tyrosine (0,56 g), la L-proline (0,4 g), le L-tryptophane (0,64 g), la L-thréonine (0,4 g), la L-phénylalanine (0,2 g), la L-asparagine-H₂O (0,2 g), la L-glutamine (0,4 g), la L-histidine-HCl (0,2 g), la L-méthionine (0,12 g), la L-alanine (0,8 g), L-lysine (0,4 g) et glutathion réduit (0,36 g) dans 500 mL d’eau désionisée.
   2. Dissoudre la L-cystéine (0,44 g) et la L-cystine (0,28 g) dans un volume minimal (~1 mL) de 1 M HCl et les ajouter à la solution d’acides aminés ci-dessus.
   3. Ajustez le pH de la solution avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH) 10 N jusqu’à ce que toutes les particules soient dissoutes. Le pH final sera de 10,0 à 11,0.
   4. Porter le volume final à 1 L avec de l’eau déminéralisée.
   5. Filtrez-stérilisez la solution et aliquote dans des volumes de 250 ml.
   6. Conserver à -20 °C.
4. Solution mère IV
   1. Dissoudre le glucose (200 g) dans de l’eau désionisée jusqu’à un volume final de 1 L.
      REMARQUE : Il peut être nécessaire de chauffer la solution pour dissoudre le glucose.
   2. Filtrer-stériliser et aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 ml.
   3. Conserver à -20 °C.
5. Solution mère V
   1. Combiner l’hypoxanthine (5,0 g), l’uracile (5,0 g) et le NaOH (4,0 g) dans de l’eau désionisée jusqu’à un volume final de 1 L.
   2. Filtrer, stériliser et aliquote dans des tubes coniques de 50 ml.
   3. Conserver à -20 °C.
6. Solution VI
   1. Préparez une solution de chlorure de calcium 1 M dihydraté ou de CaCl_{2-2H 2}O (147 g/L) dans de l’eau désionisée. Filtrer, stériliser et conserver à température ambiante (RT).
7. Solution mère VII
   1. Préparez une solution de sulfate de magnésium anhydre 1 M (MgSO₄) dans de l’eau désionisée. Filtrer, stériliser et stocker chez RT.
8. Solution mère VIII
   1. Préparez une solution de bicarbonate de sodium 1 M (NaHCO₃) dans de l’eau désionisée. Filtrer, stériliser et stocker chez RT.

2. Préparation de 4x concentré stérile et 1x CDM

REMARQUE : Cette procédure doit être effectuée dans de la verrerie stérile traitée à l’acide ou du plastique pour éviter la lixiviation des métaux dans les solutions.

1. Combiner les solutions mères I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) et V (20 mL) avec 20,0 g d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) et mélanger.
2. Ajustez le pH à 7,4, puis amenez le volume final à 500 mL avec de l’eau déminéralisée.
3. Lavez la résine Chelex-100 dans 1 L d’eau déminéralisée pour éliminer les conservateurs avant de l’ajouter au concentré stérile 4x. Pour ce faire, ajoutez 50 g de résine à 1 L d’eau déminéralisée et remuez pendant au moins 1 h. Retirez l’eau par filtration sous vide et utilisez cette résine lavée pour l’étape 2.4.
4. Ajouter 50 g de résine et remuer lentement pendant exactement 90 min.
5. Retirez la résine par stérilisation par filtre et stockez le concentré stérile 4x à 4 °C.
6. Pour préparer une concentration de travail de 1x de CDM, diluez d’abord le concentré 4x avec de l’eau désionisée stérile, puis ajoutez la solution VI (125 μL par 500 ml de solution 1x), la solution VII (535 μL par 500 mL) et la solution VIII (10 mL par 500 mL).
   REMARQUE : Bien que toutes les solutions mères aient déjà été stérilisées, il est recommandé de stériliser à nouveau la solution 1x par filtre après la préparation.

3. Préparation des plaques MDP

REMARQUE : La recette ci-dessous donne 1 L de support pour les assiettes, mais il est préférable de les préparer en plus petits volumes. Tout s’échelonne proportionnellement.

1. Agarose lavée
   1. Dissoudre 50 g d’agarose dans 1 L d’eau déminéralisée en remuant pendant 1 h.
   2. Transférez la solution dans un flacon à centrifuger et centrifugez à 1 200 x g pendant 15 min à RT. Versez soigneusement le surnageant et jetez-le.
   3. Ajouter suffisamment d’eau déminéralisée pour remettre la pastille d’agarose en suspension, puis transférer dans une fiole de 1 L. Porter à un volume final de 1 L avec de l’eau désionisée, puis agiter et centrifuger comme à l’étape 3.1.2. Jetez le surnageant.
   4. Ajoutez suffisamment d’éthanol à 100 % pour remettre la pastille en suspension, puis transférez-la dans une nouvelle fiole de 1 L. Porter à un volume final de 1 L avec de l’éthanol. Remuez et centrifugez comme à l’étape 3.1.2.
   5. Répétez l’étape 3.1.4.
   6. Ajouter du méthanol à la pastille d’agarose pour la remettre en suspension, puis transférer dans une fiole de 1 L. Porter à un volume final de 1 L avec du méthanol. Remuez et centrifugez comme à l’étape 3.1.2.
   7. Répétez l’étape 3.1.6.
   8. Transférez l’agarose lavée dans un plateau recouvert de papier d’aluminium et laissez sécher dans une hotte. Une fois sec, transférez-le dans un récipient sans métal pour un stockage à long terme.
2. Ajouter 10 g d’agarose lavée et 5 g de fécule de pomme de terre à 750 mL d’eau déminéralisée.
3. Autoclave pendant 30 min à 121 °C, 100 kPa au-dessus de la pression atmosphérique.
4. Laisser refroidir le milieu à ~65 °C, puis ajouter 250 mL de 4X CDM, 250 μL de solution VI, 1,07 mL de solution VII et 20 mL de solution VIII.
5. Si vous le souhaitez, ajoutez les métaux de votre choix avant de verser les assiettes. L’ajout de chélateurs n’est pas nécessaire pour maintenir des conditions sans métal.
6. Verser dans des boîtes de Pétri et laisser solidifier.

4. Croissance limitée en métaux de Neisseria gonorrhoeae

REMARQUE : Pour la plupart des applications, il n’est pas nécessaire de stresser les bactéries avant l’inoculation du CDM. L’étape initiale de doublement de la MDP et la dilution qui s’ensuit sont suffisantes pour épuiser les gonocoques de leurs réserves internes de fer et de zinc. Par conséquent, les deux premières étapes de la procédure suivante sont effectuées à l’aide de plaques de gélose fabriquées à partir de Gonococcus (GC) moyennement basique qui ont été complétées par le supplément I de Kellogg et 12,5 μM de nitrate ferrique (Fe(NO₃)₃). Si une contrainte métallique précoce est souhaitée, nous recommandons de préparer des plaques de base moyennes GC sans Fe(NO₃)₃ et avec 5 μM TPEN (N,N,N',N'-tetrakis (2-pyridylméthyl) éthylènediamine) pour la chélation du zinc ou 10 μM de déféroxamine pour la chélation du fer. Toute l’incubation est effectuée à 37 °C avec 5 % de CO₂.

1. Deux jours avant l’expérience, le jour -2, faire passer les gonocoques des stocks de congélation sur des plaques moyennes GC et incuber pendant au plus 24 h.
2. Le jour -1, strier les colonies individuelles sur des plaques moyennes GC fraîches. Essayez de le faire 14 à 16 heures avant l’expérience de croissance.
3. Le jour de l’expérience, ajoutez 5 à 10 ml de 1x CDM dans une fiole d’arme de poing à chicanes de 125 ml lavée à l’acide et utilisez-la pour blanchir un colorimètre Klett.
4. Utilisez un coton-tige stérile pour inoculer le CDM à partir de colonies uniques saines. Visez 20 unités Klett.
   REMARQUE : Si un colorimètre Klett n’est pas disponible, un spectrophotomètre convient également. Il n’existe pas de formule universelle de conversion des unités Klett en OD, mais un guide approximatif est disponible (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. Incuber en secouant à 250 tr/min jusqu’à ce qu’environ une masse double (40 unités Klett). Cela devrait prendre entre 1 et 2 h.
6. À ce stade, les cultures sont rediluées par l’ajout d’un volume suffisant de MDP pour atteindre la moitié de la densité de culture initiale (p. ex., si 5 mL de culture sont passés de 20 à 40 unités Klett, 15 mL de MDP la ramèneront à 10 unités Klett), et la croissance se poursuivra comme à l’étape 4.5. La quantité spécifique de rétrodilution, de traitements métalliques, etc., dépend des applications en aval. Nous en donnons trois exemples ci-dessous

5. Essais de croissance limités en métaux

REMARQUE : Ces dosages décrivent des prémélanges de croissance préfabriqués. La préparation de ces mélanges est décrite à la section 6.

1. Lors du doublement de masse à l’étape 4.5, prétraitez les puits d’une microplaque de 96 puits avec 10 prémélanges. De plus, désignez trois puits pour servir de blancs. À ces puits, ajoutez 10 μL de prémélange 10x et 90 μL de CDM.
2. Une fois que les cultures dans les flacons de poing ont doublé, ajoutez 100 μL de chaque culture dans un puits inutilisé dans la microplaque et mesurez la densité optique à 600 nm (OD600). Cela peut être fait avec des cuvettes dans un spectrophotomètre, mais avec un plus grand nombre de souches dans un test, cela peut devenir lourd et n’est généralement pas conseillé à moins que votre spectrophotomètre ne puisse mesurer directement à partir du bras du flacon du bras latéral.
   1. Pendant que vous mesurez la DO, remettez les flacons dans l’incubateur pour vous assurer que les gonocoques restent viables.
3. Calculez la quantité correcte de dilution nécessaire pour amener les cultures à DO 600 = 0,02. Les prémélanges 10x ont un effet négligeable sur la DO et peuvent être omis du calcul.
4. Diluez les cultures avec du CDM dans de petits tubes de culture et ajoutez un volume suffisant pour diluer les 10 prémélanges à 1 dans la plaque. Si un chauffe-assiette est disponible, maintenez la plaque à 37 °C pendant le travail.
5. Incuber la plaque pendant 8 à 12 h en l’agitant dans un lecteur de plaques, en prenant des mesures OD600 aux intervalles souhaités.

6. Chargement métallique de Transferrin, S100A7 et Calprotectin, et préparation de 10x prémélanges

REMARQUE : Comme pour la préparation du CDM, utilisez du verre ou du plastique lavé à l’acide pour la préparation de la solution.

1. Dissoudre la transferrine humaine à 10 mg/mL (125 μM) dans le tampon initial (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 8,4). Le S100A7 et la calprotectine sont en suspension dans un tampon composé de 20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 10 mM de 2-Mercaptoéthanol et 1 mM de chlorure de calcium ou de CaCl₂, pH = 8,0).
   1. Ajouter une solution de ferration (100 mM de citrate de sodium, 100 mM de NaHCO₃, 5 mM de chlorure de fer(III) hexahydraté ou FeCl_{3-6H 2}O, pH = 8,4) à la solution de transferrine pour obtenir une saturation en fer de 30 % (p. ex., 75 μL de solution de ferration conviennent pour 5 mL de transferrine si elle est préparée à 10 mg/mL).
   2. Ajoutez du sulfate de zinc (ZnSO₄) à S100A7 ou de la calprotectine à un rapport molaire de 50 % par rapport à la protéine pour créer une saturation de 25 % (chaque molécule de protéine a deux sites de liaison métallique). Des préparations de 100 μM S100A7 ou de calprotectine avec 50 μM ZnSO₄ peuvent être utilisées.
   3. Dans les deux cas, laisser mélanger bout à bout pendant au moins 1 h pour le chargement du métal.
2. Préparez 4 L de tampon de dialyse (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 7,4). Divisez-le en deux volumes séparés de 2 L et placez-en un à 4 °C.
3. Ajouter les protéines chargées en métal dans une cassette de dialyse à l’aide d’une seringue et dialyser contre le premier volume tampon pendant 4 h à RT.
4. Déplacez la cassette jusqu’au deuxième volume tampon et dialysez pendant la nuit à 4 °C. Après ces étapes, tous les métaux non liés doivent être éliminés.
   REMARQUE : Nous conseillons un dosage de l’acide bicinchoninique pour déterminer les concentrations de protéines après la dialyse.
5. Utilisez un prémélange de transferrine 10x pour l’utilisation de la transferrine comme seule source de fer.
   1. Préparez ce prémélange en diluant 30 % de Fe-transferrine humaine et d’apo-transferrine bovine (préparée à 125 μM comme décrit pour la transferrine humaine, sans l’étape de charge en fer) à 75 μM et 30 μM, respectivement, dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Un prémélange témoin positif remplace 30 % de Fe-transferrine par 75 μM Fe(NO)₃, et un prémélange témoin négatif omet tout ajout de fer, ne conservant que l’apo-transferrine bovine. Dans l’essai de croissance, diluer 10 μL de ces concentrés avec 90 μL de culture. Les concentrations finales sont de 7,5 μM de Fe-transferrine humaine à 30 % et de 3 μM d’apo-transferrine bovine.
6. Utilisez une version modifiée du prémélange transferrine 10x pour S100A7 ou l’utilisation de la calprotectine comme seule source de zinc.
   1. Pour un prémélange témoin positif, incorporer 50 μM de ZnSO₄ dans le prémélange de transferrine. Pour un contrôle négatif, incorporer 50 μM de TPEN et omettre le zinc. Ensuite, prélevez 10 μL de chacun de ces échantillons pour chaque échantillon bien nécessaire, et déplacez ce volume dans un nouveau tube. Ajoutez à cela la moitié du volume de PBS stérile. Par exemple, si 10 puits reçoivent le prémélange de contrôle positif, prenez 100 μL de prémélange, déplacez-le dans un nouveau tube et ajoutez 50 μL de PBS. Faites de même pour le contrôle négatif.
   2. Pour faire le prémélange S100A7 ou calprotectin, prélevez 10 μL du prémélange témoin négatif par puits nécessaire, passez à un nouveau tube et ajoutez la moitié de ce volume de Zn-S100A7 à 25 % ou de calprotectine. Dans l’essai de croissance, utiliser 15 μL de prémélange et diluer avec 85 μL de culture. Les concentrations finales des transferrines restent les mêmes qu’à l’étape 8.5, avec l’ajout de 5 μM de Zn, de TPEN ou de S100A7/calprotectine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Flacons de poing de 125 mL	Bellco	2578-S0030	Doit être commandé sur mesure
2-Mercaptoéthanol	VWR	M131	Ouvrir dans la hotte
Papier 3MM	GE Santé	3030-6461	Appelé « papier filtre » dans le texte
Agarose	Biolone	BIO-41025	Poudre
Chlorure d’ammonium	Sigma-Aldrich	N° A9434	Poudre
Transferrine bovine	Sigma-Aldrich	Réf. T1428	Poudre
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma-Aldrich	Réf. C5080	Poudre
Pantothénate de calcium	Sigma-Aldrich	Réf. C8731	Poudre
La calprotectine	N/A	N/A	Nous sommes fournis par un collaborateur
Résine Chelex-100	Bio-Rad	142-2832	Laver à l’eau déminéralisée avant utilisation
Écouvillon stérile à bout de coton	Puritain	25-806	Le coton est meilleur que le polyester pour cette application
Déféroxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Poudre
D-glucose	Sigma-Aldrich	Référence G8270	Poudre
Cassette de dialyse	Thermo	66380	Prétrempage dans le tampon avant utilisation
Éthanol	Koptec	V1016	Liquide inflammable, à conserver dans une armoire à produits inflammables
Chlorure ferrique	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, ne pas inhaler
Nitrate ferrique non ahydraté	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, ne pas inhaler
Base moyenne GC	Difco	228950	Poudre, contient déjà de l’agar
Glycine	Sigma-Aldrich	Référence G8898	Poudre
HEPES	Pêcheur	L-15694	Poudre
Transferrine humaine	Sigma-Aldrich	Réf. T2030	Poudre
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	N° H9377	Poudre
Colorimètre Klett	Manostat	37012-0000	Utilise la transmission des couleurs pour évaluer la densité de la culture
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Poudre
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Poudre
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Poudre
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Poudre
Chlorhydrate de L-cystéine	Sigma-Aldrich	Réf. C1276	Poudre
L-cystine	Sigma-Aldrich	Réf. C8755	Poudre
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Poudre
L-glutamine	Sigma-Aldrich	Réf. G3126	Poudre
Monochlorhydrate de L-histidine	Sigma-Aldrich	N° H8125	Poudre
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Poudre
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Poudre
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Poudre
L-méthionine	Sigma-Aldrich	Référence M9625	Poudre
L-phénylalanine	Sigma-Aldrich	Réf. P2126	Poudre
L-proline	Sigma-Aldrich	Réf. P0380	Poudre
L-sérine	Sigma-Aldrich	S4500	Poudre
L-thréonine	Sigma-Aldrich	Réf. T8625	Poudre
L-tryptophane	Sigma-Aldrich	Réf. T0254	Poudre
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	Réf. T3754	Poudre
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Poudre
Sulfate de magnésium	Sigma-Aldrich	Référence M7506	Poudre
Méthanol	VWR	BDH1135-4LP	Liquide inflammable, à conserver dans une armoire à produits inflammables
Phosphate de potassium dibasique	Sigma-Aldrich	60356	Poudre
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	Réf. P9791	Poudre
Sulfate de potassium	Sigma-Aldrich	Réf. P0772	Poudre
Fécule	Sigma-Aldrich	Réf. S4251	Poudre
Réduction du glutathion	Sigma-Aldrich	Référence G4251	Manipulez avec précaution. Peut s’oxyder facilement.
S100A7	N/A	N/A	Nous sommes fournis par un collaborateur
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S5761	Poudre
Chlorure de sodium	VWR	470302	Poudre
Citrate de sodium	Pêcheur	S279	Poudre
Hydroxyde de sodium	Acros Organics	383040010	Hautement hygroscopique
Chlorhydrate de thiamine	Sigma-Aldrich	Réf. T4625	Poudre
Pyrophosphate de thiamine	Sigma-Aldrich	Réf. C8754	Aussi appelée cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	Réf. P4413	Poudre
Tris	VWR	497	Poudre
Uracile	Sigma-Aldrich	Référence U0750	Poudre
Zinc sulfte heptahydraté	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, ne pas inhaler