Détection des transporteurs de métaux de surface chez Neisseria gonorrhoeae à l’aide de Dot Blot

Résumé

Source : Maurakis, S., et Cornelissen, C. N. Croissance limitée aux métaux de Neisseria gonorrhoeae pour la caractérisation des gènes sensibles aux métaux et l’acquisition de métaux à partir de ligands hôtes. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre la procédure de détection des transporteurs de métaux de surface chez Neisseria gonorrhoeae cultivée dans des conditions limitées en métaux à l’aide d’un test par transfert de points, impliquant la liaison de ligands, la détection d’anticorps et la visualisation colorimétrique.

Protocole

1. Détection de la liaison du ligand par les transporteurs métalliques à membrane externe

1. Diluez les cultures avec trois volumes de CDM (milieu défini traité au chélex).
2. Ensuite, incubez en secouant pendant 4 h.
3. Peu avant la marque des 4 h, coupez trois morceaux de papier filtre et un morceau de nitrocellulose à la taille approximative nécessaire pour tenir dans un appareil à tampon de points. Prétrempez la nitrocellulose dans de l’eau déminéralisée, puis assemblez l’appareil avec du papier filtre sous la nitrocellulose.
4. À 4 h, enregistrer les densités cellulaires et normaliser jusqu’à une densité finale appropriée.
5. Pipetez les cultures cellulaires sur la nitrocellulose et laissez suffisamment de temps au papier filtre pour absorber tout le liquide.
6. Démontez l’appareil, laissez sécher le tampon et bloquez la membrane de nitrocellulose pendant 1 h dans de l’albumine sérique bovine à 5 % ou du lait écrémé (p/v) dans une solution saline tamponnée au Tris.
7. Remontez l’appareil de transfert de points, en remplaçant le papier filtre par un film de paraffine pour créer un joint étanche sous la nitrocellulose.
8. Diluer le ligand de liaison métallique d’intérêt à 0,2 μM dans les cellules bloqueuses et sondes pendant 1 h.
9. Siphonnez le liquide sous vide, lavez le tampon, puis suivez les procédures immunologiques standard pour développer le signal. Les étapes de lavage peuvent être effectuées à l’intérieur ou à l’extérieur de l’appareil.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Flacons de poing de 125 mL	Bellco	2578-S0030	Doit être commandé sur mesure
2-Mercaptoéthanol	VWR	M131	Ouvrir dans la hotte
Papier 3MM	GE Santé	3030-6461	Appelé « papier filtre » dans le texte
Bloqueur de qualité buvard	Bio-Rad	170-6404	Lait écrémé en poudre
Albumine sérique bovine	Roche	3116964001	Poudre
La calprotectine	N/A	N/A	Nous sommes fournis par un collaborateur
Résine Chelex-100	Bio-Rad	142-2832	Laver à l’eau déminéralisée avant utilisation
Écouvillon stérile à bout de coton	Puritain	25-806	Le coton est meilleur que le polyester pour cette application
Appareil de transfert de points	Schleicher et Schwell	10484138	Verrouillez le couvercle aussi hermétiquement que possible avant le chargement de l’échantillon
Éthanol	Koptec	V1016	Liquide inflammable, à conserver dans une armoire à produits inflammables
Colorimètre Klett	Manostat	37012-0000	Utilise la transmission des couleurs pour évaluer la densité de la culture
Méthanol	VWR	BDH1135-4LP	Liquide inflammable, à conserver dans une armoire à produits inflammables
Nitrocellulose	GE Santé	10600002	Conserver dans une gaine de protection jusqu’à l’utilisation
S100A7	N/A	N/A	Nous sommes fournis par un collaborateur
Chlorure de sodium	VWR	470302	Poudre
Tris	VWR	497	Poudre