Mesure des taux d’erreur de traduction de Mycobacterium smegmatis à l’aide d’un système de rapporteur GFP/luciférase

Résumé

Source : Chen, Y., et al., Mesure de taux spécifiques d’erreur de traduction mycobactérienne avec des systèmes rapporteurs de gain de fonction. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo présente une méthode pour quantifier les erreurs de traduction chez Mycobacterium smegmatis à l’aide d’une GFP inductible et d’un système de rapporteur de luciférase mutante sécrétée. Il montre comment la luminescence résultant d’une erreur de traduction est mesurée et comparée à la fluorescence GFP pour évaluer l’impact d’une molécule de test sur la précision de la traduction.

Protocole

1. Nanoluc luciférase (Nluc)/Protéine fluorescente verte (GFP) rapporteur

NOTE: Pour une représentation visuelle de cette méthode, voir la figure 1.

1. Inoculer la souche rapporteure bactérienne à partir d’un produit d’origine à -80 °C avec 2 mL de milieu 7H9. Agiter à 37 °C pendant 1 à 2 jours jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne la phase stationnaire (DO >3).
2. Sous-cultiver à 50 mL de milieu 7H9 et croître jusqu’à ce que OD₆₀₀ atteigne la phase stationnaire tardive (>4).
3. Avant d’aliquote les bactéries sur une plaque à 96 puits, ajoutez de l’anhydrotétracycline (ATC) à une concentration finale de 50 ng/mL et mélangez bien. L’induction de la culture en vrac garantit que tous les puits contiennent la même quantité d’inducteur et que l’induction du rapporteur est synchronisée. Aliquote les bactéries dans une plaque transparente à fond rond de 96 puits, avec un volume de 100 μL dans chaque puits.
4. Pour dépister les petites molécules affectant les taux de mauvaise traduction, ajoutez le composé à la concentration indiquée pour sélectionner les puits. Aux fins de ce protocole, utiliser la kasugamycine (aux doses indiquées à la figure 2) à titre d’illustration. Ajoutez différentes doses de kasugamycine pour sélectionner les puits (chaque groupe expérimental doit contenir au moins deux réplicats biologiques).
5. Agiter et induire les échantillons à 37 °C pendant 16 à 20 h.
   NOTE: Il est nécessaire de sceller la plaque avec un film. De plus, tous les puits de bordure doivent être remplis d’au moins 200 μL d’eau stérile pour limiter l’évaporation des puits d’essai.
6. Prélever 80 μL de chaque puits, à l’aide d’une pipette multicanaux, et transférer les échantillons sur une plaque noire à 96 puits (ce qui maximise la mesure du signal de fluorescence). Mesurez le signal GFP par luminomètre avec 20 ms comme temps d’intégration.
7. Après avoir mesuré le signal GFP, centrifugez la plaque à 3 220 x g pendant 10 min. Transférez 50 μL du surnageant sur une plaque à fond blanc de 96 puits (ce qui maximise la mesure du signal de luminescence), ajoutez 50 μL de substrat Nluc dans chaque puits, mélangez-les bien et mesurez la luminescence par luminomètre avec 1 000 ms comme temps d’intégration.
8. Déterminez le rapport Nluc/GFP en divisant les valeurs de luminescence Nluc corrigées par la fluorescence GFP : cette mesure (en unités arbitraires) est une mesure relative de l’aspartate pour les erreurs de traduction de l’asparagine.

Résultats

Figure 1 : Schéma de mesure du taux d’erreur de traduction Nluc-GFP rapporteur. Une nouvelle culture de M. smegmatis, transformée avec les rapporteurs Nluc et GFP, est cultivée jusqu’à un volume suffisant pour que toutes les plaques soie...

Matériaux