Synchronisation des cultures cyanobactériennes et compactage de l’ADN pilotés par des cycles lumière-obscurité

Résumé

Source : Murata, K. et. al., Visualisation de la compaction de l’ADN chez les cyanobactéries par cryotomographie électronique à haute tension. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre la culture synchrone de cyanobactéries dans des cycles lumière-obscurité pour étudier la compaction de l’ADN régulée par le rythme circadien. La microscopie à fluorescence révèle de l’ADN condensé à des moments définis, confirmant l’alignement du cycle cellulaire dans la population.

Protocole

1. Culture synchrone de cyanobactéries

1. Culture de Synechococcus elongatus PCC 7942 sur une plaque stérilisée en milieu bleu-vert 11 (BG 11) (dans une boîte de Pétri en plastique stérile de 9 cm) contenant 1,5 % (p/v) de gélose et 0,3 % (p/v) de thiosulfate de sodium.
2. Placez les plaques dans une chambre de croissance à 23 °C avec une intensité lumineuse de 50 μE/m²/s et soumettez-les à des cycles de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité.
3. Transférez les cellules sur des plaques de gélose BG11 fraîches une fois par semaine.
   NOTE: Les cultures sur la gélose apparaîtront sous forme de bandes vertes de cellules en prolifération active après une semaine dans ces conditions de culture.
4. Prenez des amas verts de cellules avec une boucle de fil stérilisée à la flamme et striez les cellules sur une plaque de gélose BG11 fraîche. Faites-le sur un banc propre.

2. Surveillance par microscopie à fluorescence

1. Utilisez des cellules cultivées sur la plaque de gélose pendant 6 jours pour observer le compactage de l’ADN. Prélever les cellules de la plaque à la fin de la période de lumière en versant 1 mL de solution de saccharose 0,2 M sur les cellules. Versez à nouveau la solution sur les cellules afin que la plupart des cellules soient collectées. Transférez la solution de cellules en suspension dans un microtube pour la coloration de l’ADN.
2. Ajouter une solution de colorant de coloration de l’ADN (p. ex., Hoechst 33342) à 500 μL de solution de cellules en suspension dans un microtube jusqu’à une concentration finale de 1 μg/mL. Ensuite, gardez le tube dans l’obscurité pendant 10 min.
3. Centrifuger pendant 1 min à 2 000 x g pour sédimenter les cellules. Jeter le surnageant et ajouter 10 μL de solution de saccharose 0,2 M pour obtenir une suspension cellulaire dense.
4. Transférez 1 μL de la solution contenant des cellules colorées dans une vitre de lame, placez une lamelle et observez avec un microscope à fluorescence équipé d’un filtre ultraviolet (UV) à l’aide d’une lentille d’objectif avec un grossissement de 100X et de l’huile d’immersion.
5. Confirmez que la compaction de l’ADN est observée à ce stade dans la plupart des cellules.

Matériaux