Synthèse d’antigènes protéiques membranaires stabilisés à l’aide d’un système acellulaire

Résumé

Source : Gilmore, S. F., et al. Production à l’échelle acellulaire et ajout d’un adjuvant à une protéine majeure de membrane externe recombinante de Chlamydia muridarum pour le développement d’un vaccin. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre la synthèse acellulaire d’antigènes protéiques membranaires stabilisés par des nanodisques à l’aide d’un système à deux compartiments. Le dispositif maintient des conditions optimales pour une synthèse efficace des protéines, un bon repliement et une intégration stable dans les nanodisques.

Protocole

Production acellulaire de particules de nanolipoprotéines de protéines de télodendrimère de la membrane externe (MOMP-tNLP) pour les formulations de vaccins sous-unitaires

1. Préparez les MOMP-tNLP en utilisant des méthodes acellulaires.
   1. Deux heures avant de mettre en place la réaction acellulaire, ouvrez le kit d’expression de protéines acellulaires procaryotes et décongelez l’un des tampons de reconstitution. Une fois décongelé, ajoutez un comprimé de cocktail d’inhibiteurs de protéase sans acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et laissez-le se dissoudre complètement.

2. Suivez ce protocole à l’aide d’un kit conçu pour exécuter 5 réactions de 1 ml.

   NOTE: Une production à grande échelle typique est de 3 x 1 mL.

   1. Pour chaque réaction de 1 mL, ajoutez 525 μL de tampon de reconstitution dans le flacon de lysat d’E. coli et roulez doucement pour dissoudre. Ajouter 250 μL de tampon de reconstitution dans le flacon contenant des additifs de réaction (p. ex., adénosine triphosphate, guanosine triphosphate) et rouler doucement pour dissoudre.
   2. Ajoutez 8,1 ml de tampon de reconstitution dans le biberon d’alimentation par réaction, rebouchez avec un bouchon en caoutchouc (veillez à ne pas toucher l’intérieur du bouchon en caoutchouc) et retournez/roulez doucement pour dissoudre.
   3. Ajoutez 3 ml de tampon de reconstitution dans la bouteille de mélange d’acides aminés, rebouchez avec un bouchon en caoutchouc et retournez/roulez doucement pour dissoudre.
      NOTE: Veillez à ne pas toucher l’intérieur du bouchon en caoutchouc car cela peut entraîner une contamination.
   4. Ajoutez 1,8 ml de tampon de reconstitution dans la bouteille de méthionine, roulez doucement pour dissoudre, puis conservez-le sur de la glace jusqu’à utilisation.
       
3. Préparez la solution réactionnelle.
   1. Dans le flacon de lysat d’E. coli , ajoutez 225 μL de mélange réactionnel reconstitué, 270 μL de mélange d’acides aminés reconstitué sans méthionine et 30 μL de méthionine reconstituée. De plus, ajoutez 400 μL du mélange 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)/télodendrimère, 15 μg de plasmide MOMP et 0,6 μg de plasmide Δ49ApolipoproteinA1. Rouler/secouer doucement pour mélanger.
      NOTE: Assurez-vous que les deux plasmides sont construits à partir du même squelette plasmidique. Ne faites pas de vortex.
   2. Prélever 20 μL de la solution totale et la réserver dans un tube de 1,5 mL pour la réaction de contrôle exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) (voir ci-dessous).
       
4. Préparez la solution alimentaire. Dans le flacon de mélange d’aliments, ajoutez 2,65 mL de mélange d’acides aminés reconstitués sans méthionine et 300 μL de méthionine reconstituée. Rouler/secouer doucement pour dissoudre.
   NOTE: À ce moment-là, le tampon de reconstitution inutilisé et la méthionine peuvent être remis au congélateur pour être stockés.
    
5. Transférez 1 mL de la solution réactionnelle dans la chambre de réaction interne fournie dans la trousse de réaction acellulaire et scellez-la une fois remplie. Transférez 10 mL de la solution d’alimentation dans la chambre extérieure du récipient de réaction et scellez-le.
   NOTE: Ne remplissez pas trop les chambres ! La présence de bulles d’air au sommet de la chambre de réaction interne et de la chambre d’alimentation interne affectera négativement la réaction. Toute solution réactionnelle restante peut être placée dans un tube de 1,5 mL et laissée mélanger avec le récipient principal.
    
6. Ajouter 0,5 μL du plasmide témoin GFP (0,5 mg/mL) au mélange réactionnel de 20 μL précédemment aliquote.
   NOTE: De nombreux kits sont fournis avec un plasmide de contrôle à des fins de contrôle de la qualité. La plupart des plasmides exprimant la GFP avec un promoteur T7 et un site de liaison au ribosome (RBS) d’E. coli peuvent également être utilisés comme plasmide de contrôle.
    
7. Placez la réaction dans un agitateur à 300 tr/min, 30 °C jusqu’à 18 h. Pour vérifier que la réaction a réussi, utilisez une source de lumière UV pour vérifier la fluorescence due à la synthèse de la GFP de contrôle (figure 1) après aussi peu que 15 minutes d’incubation.
   NOTE: Ces conditions, en particulier la température, peuvent avoir besoin d’être optimisées pour l’expression d’autres protéines membranaires.

Résultats

Figure 1 : Expression et purification de MOMP-tNLP. (A) Image de tubes contenant de petites aliquotes d’une réaction acellulaire qui a réussi à exprimer des contrôles GFP illuminant sous une source de lumière UV (à d...

Matériaux