Western Blot pour l’évaluation de l’intégrité structurelle d’un antigène vaccinal bactérien

Résumé

Source : Gilmore, S. F. et al. Production à l’échelle acellulaire et ajout d’un adjuvant à une protéine majeure de membrane externe recombinante de Chlamydia muridarum pour le développement d’un vaccin. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre l’utilisation du Western blot pour évaluer l’intégrité structurelle de la principale protéine de membrane externe (MOMP) dans des complexes vaccinaux à base de nanoparticules. Il décrit les étapes clés du transfert de protéines, du marquage des anticorps et de l’imagerie par fluorescence.

Protocole

1. Transfert Western

1. Pour le western blot, résoudre les particules de nanolipoprotéines télodendrimères (tNLP) de la protéine principale de la membrane externe (MOMP) par SDS-PAGE et transférer les gels à l’aide d’un système de transfert sec commercial avec des réglages standard selon le protocole du fabricant.
   1. Une fois le transfert terminé, il faut retirer les transferts et incuber chaque transfert pendant une nuit à 4 °C dans un tampon bloquant approprié contenant 0,2 % de Tween 20 et 0,5 mg/mL d’anticorps monoclonal (MAb) 40 ou 0,2 mg/mL d’anticorps anti-His-tag MAbHIS dirigé contre le His-tag de la protéine Δ49ApoA1.
      NOTE: Les dilutions d’anticorps utilisées pour le transfert sont de 1:1 000 pour le MAb40 et de 1:500 à 1 000 pour l’anticorps MAbHIS.
   2. Lavez chaque tache 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS-T (1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 0,2 % Tween 20, pH 7,4).
   3. Incuber les transferts pendant 1 h dans un tampon de blocage contenant un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore (p. ex., colorant infrarouge [IRDye]) à une dilution de 1:10 000.
   4. Lavez à nouveau les taches 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS-T. Utilisez un imageur à fluorescence pour imager les taches après le lavage final.

Matériaux