Préparation et transformation de bactéries par électroporation à haute tension

Résumé

Source : Stefan, A., et al., Les avantages multiformes de la co-expression des protéines chez Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo montre la procédure de transformation d’Escherichia coli avec un plasmide porteur d’un gène de résistance aux antibiotiques, y compris la préparation cellulaire, l’électroporation, la récupération et la sélection des transformants.

Protocole

1. Isolement des co-transformants d’E. coli

1. Préparez des cellules électrocompétentes de la souche appropriée d’E. coli à transformer. Transférez dans 1 ml de milieu Luria-Bertani (LB) (tryptone, extrait de levure, NaCl à 10, 5 et 10 g/L, respectivement) une seule colonie de la souche de votre choix, et incubez à 37 °C dans des conditions d’agitation de 180 tr/min. Diluer la pré-culture 1:500 dans 25 ml de milieu LB frais et incuber la culture à 37 °C.
2. En phase logarithmique (0,6 OD ou densité optique), centrifuger la suspension cellulaire à 5 000 x g pendant 20 min, et remettre la pastille en suspension dans 10 %, v/v d’eau glycérolique stérile glacée dans la moitié du volume de culture d’origine. Répétez cette étape 4 fois, en réduisant de moitié le volume de remise en suspension. Enfin, remettez la pastille en suspension dans du glycérol/de l’eau et divisez la suspension cellulaire en aliquotes de 50 μl. Conservez les aliquotes à -80 °C jusqu’à 6 mois.
3. Dissoudre le plasmide souhaité dans de l’eau stérile enrichie de 0,5 mM d’EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique). Décongelez une aliquote de cellules électro-compétentes sur de la glace et mélangez avec une quantité appropriée (2,5-5 ng) de vecteur. Verser le mélange dans une cuvette de 0,1 cm adaptée à l’électroporation et appliquer 1,8 kV.
4. Transférez immédiatement les cellules électroporées dans 1 ml de milieu SOC (bouillon super optimal avec répression catabolite) (milieu LB complété par 0,2 % p/v de glucose, 10 mM MgCl₂, 2,5 mM KCl), incubez pendant 1 heure en agitant, et enfin transférez 100 μl d’aliquotes dans des boîtes de Pétri contenant de la gélose LB avec l’antibiotique approprié. Incuber O/N à 37 °C.
5. Purifiez les transformants en striant des colonies uniques sur des boîtes de Pétri.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar-agar	Sigma-Aldrich	N° A1296
Ampicilline	Sigma-Aldrich	A9518
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycérol	Sigma-Aldrich	Référence G5516
Kcl	Sigma-Aldrich	P9541
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Extrait de levure	Fluka	70161
Cuvettes 0,1 cm	BioRad	1652089	Pour l’électroporation
Centrifugeuse 5415R	Eppendorf
Centrifugeuse Allegra 21R	Beckman
Électroporation Gene Pulser II	BioRad