Évaluation de la fréquence des mutations chez les bactéries à l’aide du dosage de la bêta-glucosidase

Résumé

Source : Stefan, A., et al. Les avantages à multiples facettes de la co-expression des protéines chez Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), (2015).

Cette vidéo démontre l’évaluation de la fréquence des mutations chez les bactéries à l’aide d’un test de bêta-glucosidase. Des cultures bactériennes exprimant une ADN polymérase déficiente en relecture sont collectées sur des générations successives. Les erreurs de réplication causées par une relecture réduite peuvent activer un gène de la bêta-glucosidase supprimé. Après centrifugation et perméabilisation, un substrat est ajouté et l’activité enzymatique est mesurée pour quantifier la fréquence des mutations dans les échantillons.

Protocole

1. Isolement des cotransformants d’Escherichia coli ou d’E. coli

1. Préparez des cellules électrocompétentes de la souche appropriée d’E. coli à transformer. Transvaser dans 1 ml de milieu Luria-Bertani (LB) (tryptone, extrait de levure, chlorure de sodium ou NaCl à 10, 5 et 10 g/L, respectivement) une seule colonie de la souche de votre choix, et incuber à 37 °C dans des conditions d’agitation de 180 tr/min. Diluer la pré-culture 1:500 dans 25 ml de milieu LB frais et incuber la culture à 37 °C.
2. En phase logarithmique (0,6 OD), centrifuger la suspension cellulaire à 5 000 x g pendant 20 min, et remettre la pastille en suspension dans 10 %, v/v d’eau glycérolique stérile glacée dans la moitié du volume de culture d’origine. Répétez cette étape 4 fois, en réduisant de moitié le volume de remise en suspension à chaque fois. Enfin, remettez la pastille en suspension dans du glycérol/de l’eau et divisez la suspension cellulaire en aliquotes de 50 μl. Conservez les aliquotes à -80 °C jusqu’à 6 mois.
3. Dissoudre le plasmide souhaité dans de l’eau stérile additionnée de 0,5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Décongeler sur de la glace une aliquote de cellules électro-compétentes et mélanger avec une quantité appropriée (2,5-5 ng) de vecteur. Verser le mélange dans une cuvette de 0,1 cm adaptée à l’électroporation et appliquer 1,8 kV.
4. Transférez immédiatement les cellules électroporées dans 1 ml de bouillon super optimal avec milieu de répression catabolite (SOC) (milieu LB complété par 0,2 % p/v de glucose, 10 mM de chlorure de magnésium ou MgCl₂, 2,5 mM de chlorure de potassium ou KCl), incubez pendant 1 heure en secouant, et enfin transférez 100 μl d’aliquotes dans des boîtes de Pétri contenant de la gélose LB avec l’antibiotique approprié. Incuber toute la nuit (non/nuit) à 37 °C.
5. Purifiez les transformants en striant des colonies uniques sur des boîtes de Pétri.
6. Préparez des cellules électrocompétentes des transformants primaires et répétez les étapes 1.1 à 1.5 pour transformer avec d’autres plasmides.
7. Préparez des stocks de glycérol des co-transformants. Transvaser une seule colonie dans des LB complétées par les antibiotiques appropriés, incuber à 37 °C en agitant, et en phase logarithmique (0,6 O.D.), centrifuger la suspension cellulaire à 5 000 x g pendant 20 min. Remettre la pastille en suspension dans un milieu d’antibiotiques LB contenant 15 % v/v de glycérol. Distribuer dans des aliquotes et conserver à – 80 °C.

2. Analyse des mutations des populations co-exprimant la sous-unité ε de type sauvage de l’ADN polymérase III d’E. coli et la variante mutagène εD12A

1. Transférez une seule colonie d’E. coli TOP10 contenant les vecteurs pBAD-ε et pGOOD1-εD12A dans 1 ml de milieu d’antibiotiques LB. Incuber O/N à 37 °C.
2. Diluer la pré-culture au 1:250 dans 3 flacons contenant du milieu frais (10 ml), ajouter les inducteurs appropriés (arabinose, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), ou arabinose et IPTG de 1 mM chacun) et incuber à 37 °C pendant 8 h. Préparer en parallèle des cultures non induites.
3. Prélever des aliquotes de 1 ml, puis diluer 1:500 dans des flacons neufs contenant du milieu frais (10 ml) complété ou non par les inducteurs appropriés. Incuber O/N à 37 °C.
4. Répéter les étapes 2.2 et 2.3 et prélever des aliquotes de 1 ml.
5. Déterminez le nombre de générations qui se sont produites dans chaque culture. Transfert sur plaques LB, 100 μl de dilutions en série appropriées d’inoculum et de culture. Incuber O/N à 37 °C. Compter les colonies sur les plaques LB et calculer le log du nombre de cellules présentes dans l’inoculum (log_I) et dans la culture en fin de croissance (log_C). Pour déterminer le nombre de générations, utilisez la formule : (log_C– log_I)/0,301.
6. Centrifuger à 5 000 x g pendant 20 min et remettre les cellules en suspension dans 1 ml de chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris-HCl) de 50 mM, pH 7,6, 50 mM de NaCl. Pour perméabiliser les cellules, ajoutez 2-3 gouttes de chloroforme et vortex pendant 20 secondes.
7. Déterminer l’activité β-glucosidase de chaque aliquote dans une microplaque de 96 puits, en utilisant le p-nitrophényl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc) comme substrat. Ajouter à chaque puits 100 μl de cellules perméabilisées et 100 μl de substrat (16 mg/ml de solution mère dans de l’eau ou du H₂O). Veillez à éviter les bulles d’air dans les puits. Lire l’absorbance à 420 nm, à l’aide d’un lecteur de microplaques et du filtre approprié.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar-agar	Sigma-Aldrich	N° A1296
Ampicilline	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroforme	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycérol	Sigma-Aldrich	Référence G5516
L’IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
Kcl	Sigma-Aldrich	P9541
L-arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N° N7006
Tétracycline	Sigma-Aldrich	87128
Base Trizma	Sigma-Aldrich	Réf. T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Extrait de levure	Fluka	70161
Cuvettes 0,1 cm	BioRad	1652089	Pour l’électroporation
Centrifugeuse 5415R	Eppendorf
Centrifugeuse Allegra 21R	Beckman
Appareil de chromatographie GradiFrac	Pharmacia Biotech
Électroporation Gene Pulser II	BioRad
Lecteur de microplaques 550	Biorad
MiniProtean 3 cellules	BioRad
Alimentation	BioRad