Extraction et purification de plastoglobules à partir de bactéries photosynthétiques

Résumé

Source : Shivaiah, K., et al. Isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobules à partir de tissus foliaires de plantes et de cyanobactéries. J. Vis. Exp. (2022)

La vidéo montre l’isolement des plastoglobules des cyanobactéries. Elle commence par une culture de cyanobactéries et se poursuit par la rupture cellulaire à l’aide de la force mécanique. La libération de pigments photosynthétiques indique une lyse réussie. Un gradient de pas de saccharose est ensuite utilisé pour séparer les composants cellulaires par densité, permettant aux plastoglobules de faible densité de former une bande distincte au sommet. Cette fraction est recueillie et conservée pour une analyse plus approfondie.

Protocole

1. Isolement grossier des plastoglobules

1. Extraction brute de plastoglobules à partir de cyanobactéries
   1. Cultivez une culture de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 jusqu’à la phase stationnaire (environ 7 à 10 jours) et ajustez la densité cellulaire à une densité optique à 750 nm (OD₇₅₀) de 2,0 à l’aide d’un spectrophotomètre. Pour les conditions de culture, utilisez un milieu BG-11 et cultivez dans un incubateur à une intensité lumineuse de 150 μmol de photons/m²/s, 2 % de CO₂, 32 °C, et avec une agitation continue à 150 tours par minute (tr/min).
   2. Pour éliminer les polysaccharides, laver les cellules en centrifugeant la culture de 50 mL à 6 000 × g pendant 45 min à 4 °C, puis en retirant le surnageant. Continuez en lavant les cellules deux fois dans 50 mL de tampon A (tableau 1). Prélever une aliquote de l’homogénat de cellule et la mettre de côté avant la centrifugation pour être stockée en tant qu’échantillon total représentatif de la cellule
   3. Remettre la pastille lavée en suspension dans 25 mL de tampon A et briser les cellules à l’aide d’une cellule à pression française à 1 100 livres par pouce carré (psi), en répétant le processus 3× (mettre l’échantillon sur de la glace entre chaque cycle pour éviter la dénaturation des protéines) jusqu’à ce que la couleur lysée passe du vert au rouge-bleu-vert sous lumière blanche. Utilisez une cellule pré-refroidie et effectuez cette étape dans la chambre froide.
   4. Répartissez l’homogénat obtenu entre huit tubes d’ultracentrifugation de 3 mL remplis jusqu’à un maximum de 2,5 mL dans chaque tube, puis recouvrez-le soigneusement de 400 μL de milieu R, produisant un gradient de gradation.
   5. Équilibrez soigneusement les tubes en ajoutant du milieu R supplémentaire, si nécessaire, et centrifugez pendant 30 min à 150 000 × g à 4 °C. Le thylakoïde et d’autres organites plus lourds (y compris les corps polyhydroxyalcanoates) se granuleront, tandis que les plastoglobules seront facilement visibles sous la forme d’un coussinet jaune et huileux sur ou près du sommet du gradient de saccharose (figure 1C).
   6. Récoltez le tampon flottant de plastoglobules bruts obtenu à l’aide d’une seringue et d’une aiguille 22G et déposez-le dans un tube de 2 ml. Grattez les plastoglobules sur le côté de la paroi du tube d’ultracentrifugation avec la pointe de l’aiguille si nécessaire.
   7. Passez à l’étape 2.2. Vous pouvez également stocker les plastoglobules bruts à -80 °C et les purifier plus tard.

Tableau 1 : Recettes de tampons pour l’isolement des plastoglobules à partir de tissus foliaires de plantes ou de cyanobactéries.

Compositions tampons a
Tampon de broyage	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM de chlorure de magnésium (MgCl2)
	100 mM de sorbitol
	5 mM d’acide ascorbique b
	5 mM de cystéine b réduite
	0,05 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) b
R moyen	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
R moyen 0,2	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,2 M de saccharose
R moyen 0,7	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,7 M de saccharose
Zone tampon A	25 mM HEPES-KOH (pH 7,8)
	250 mM de saccharose
un. Les concentrations finales de chaque composant de la zone tampon sont fournies.
b. Doit être ajouté frais le jour de l’isolement. Bien que les tampons puissent être préparés la veille de l’isolement, certains ingrédients doivent être ajoutés frais le jour de l’isolement, ainsi que les inhibiteurs de la phosphatase et de la protéase.

2. Récolte des plastoglobules purs

1. Traitement des cyanobactéries
   1. Produire un gradient de saccharose dans quatre tubes d’ultracentrifugation de 2,5 ml, superposés d’abord avec 500 μL de plastoglobules bruts de l’étape 1.3 mélangés à 750 μL de milieu R 0,7, puis superposés avec 750 μL de milieu R 0,2.
   2. Centrifuger le gradient de saccharose à 150 000 × g pendant 90 min à 4 °C. Prélever les plastoglobules purs (figure 1C) à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 22 G de la phase supérieure du gradient de saccharose et les transférer dans un tube de 1,5 mL.
   3. Aliquote les plastoglobules purs et congélation instantanée dans de l’azote liquide. Conserver directement à −80 °C ou lyophiliser en une poudre sèche.

Résultats

Figure 1 : Isolement et immunoblotting de plastoglobules et de thylakoïdes. (A) Un échantillon représentatif de plastoglobule purifié de Z. mays avant l’extraction du gradient de saccharose. (B) Un éc...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ascorbate	BDH	BDH9242
Albumine sérique bovine	Proliant Biologique	68700
Cellule de pression française (modèle FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	N° H3375
Chlorure de magnésium	Sigma Aldrich	Référence M8266
Incubateur à secousses Multitron	Infors HT	N/A
Hydroxyde de potassium	Produits chimiques Fisher	Référence M16050
Cystéine réduite	MP Biochimie	101444
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Saccharose	Sigma Aldrich	S9378
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Ultracentrifugeuse Optima MAX-TL	Beckman Coulter	N° A95761