Purification par gradient de densité des plastoglobules cyanobactériens

Résumé

Source : Shivaiah, K., et al. Isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobules à partir de tissus foliaires de plantes et de cyanobactéries. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo démontre l’isolement des plastoglobules des cyanobactéries à l’aide de la centrifugation par gradient de densité de saccharose, mettant en évidence leur nature riche en lipides et à faible densité et assurant leur préservation structurelle pour l’analyse en aval.

Protocole

1. Récolte de plastoglobules purs

1. Traitement des cyanobactéries
   1. Produire un gradient de saccharose dans quatre tubes d’ultracentrifugation de 2,5 mL superposés d’abord avec 500 μL de plastoglobules bruts de l’étape 1.3 mélangés à 750 μL de milieu R 0,7, puis superposer avec 750 μL de milieu R 0,2 (tableau 1)
   2. Centrifuger le gradient de saccharose à 150 000 x g pendant 90 min à 4 °C. Prélever les plastoglobules purs (figure 1C) à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 22 G de la phase supérieure du gradient de saccharose et les transférer dans un tube de 1,5 mL.
   3. Aliquote les plastoglobules purs et congélation instantanée dans de l’azote liquide. Conserver directement à −80 °C ou lyophiliser en une poudre sèche.

Tableau 1 : Recettes de tampons pour l’isolement des plastoglobules des cyanobactéries.

R moyen	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
R moyen 0,2	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,2 M de saccharose
R moyen 0,7	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,7 M de saccharose

Résultats

Figure 1 : Isolement et immunoblotting de plastoglobules et de thylakoïdes. (A) Un échantillon représentatif de plastoglobule purifié de Z. mays avant l’extraction du gradient de saccharose. (B) Un éc...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
HEPES	Sigma Aldrich	N° H3375
Chlorure de magnésium	Sigma Aldrich	Référence M8266
Saccharose	Sigma Aldrich	S9378
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Ultracentrifugeuse Optima MAX-TL	Beckman Coulter	N° A95761