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1. Nourrir les vers avec des bactéries vivantes en culture liquide
NOTE: Ce protocole est utilisé pour coloniser les vers avec des bactéries cultivées en laboratoire dans des conditions bien mélangées en culture liquide. Les vers peuvent être colonisés par des isolats individuels provenant de cultures pures (p. ex. d’agents pathogènes comme Enterococcus faecium) ou de mélanges d’isolats (p. ex. communautés de microbiome minimales).
- Commencez avec des vers adultes synchronisés lavés au saccharose dans un tube conique de 15 ml. Lavez les vers une fois dans 12 mL de tampon S et jetez le surnageant.
- Remettez les vers lavés en suspension dans le volume de milieu S nécessaire à l’expérience. Considérez le volume des conditions expérimentales, le nombre de conditions sur lesquelles les vers seront divisés et les concentrations finales de vers et de bactéries.
NOTE: L’alimentation des vers varie en fonction de la disponibilité des bactéries et les vers peuvent être stressés par l’encombrement. Pour la colonisation en culture liquide, <1000 vers/mL et >107 UFC/mL sont recommandés ; 1011 UFC/mL est considéré comme une densité alimentaire « ad libitum » chez E. coli. - Faites tourner les cultures bactériennes. Videz le surnageant ; L’aspiration ou le pipetage peuvent être utilisés pour éliminer le surnageant des bactéries qui forment des granulés en vrac.
NOTE: Pour les cultures >5 mL, transférez dans des tubes de 15 mL et faites tourner à ~2800 x g dans une grande centrifugeuse de table pendant 8 à 10 min. Les cultures <5 mL peuvent être transférées dans des tubes de 1,5 mL et centrifugées à 9000 x g pendant 1 à 2 min dans une petite centrifugeuse de table. Les bactéries très mobiles (p. ex., de nombreuses espèces de Pseudomonas) peuvent avoir besoin d’être refroidies à 4 °C pendant 10 à 15 minutes pour faciliter la formation d’une pastille stable, et il peut être préférable de centrifuger à 4 °C. - Remettre en suspension les cultures bactériennes dans un volume de tampon S et centrifuger à nouveau en granulés. Retirez et jetez le surnageant comme précédemment.
- Remettre en suspension les cultures bactériennes dans le milieu S à la densité souhaitée pour l’expérience, ainsi que les antibiotiques pour la sélection. Les antibiotiques à utiliser, le cas échéant, dépendront du profil de résistance des bactéries utilisées pour la colonisation.
- À l’aide d’une pointe de pipette recouverte d’un tampon à vis sans fin M9 complété par 0,01 % de Triton X-100 (M9TX-01), les vers pipette montent et descendent doucement jusqu’à ce que les vers soient complètement remis en suspension dans le milieu S, puis transfèrent dans des tubes ou des puits de plaque pour la colonisation bactérienne.
- Ajoutez une suspension bactérienne à chaque culture de vers pour atteindre la concentration bactérienne et le volume final souhaités.
- Si vous utilisez une plaque multipuits pour la colonisation, recouvrez la plaque d’une membrane d’étanchéité stérile perméable au gaz à 96 puits.
- Incuber en secouant à 200 tr/min pour éviter que les bactéries ne se déposent pendant l’incubation.
2. Perturbation mécanique de vers individuels dans un format de 96 puits
NOTE: Cette section décrit un protocole de format de plaque à 96 puits pour la perturbation mécanique de C. elegans colonisés par des bactéries. Les premières étapes du protocole décrivent une méthode pour purger les bactéries non adhérentes de l’intestin du ver et nettoyer l’extérieur des vers à l’aide de la paralysie froide et du blanchiment de surface. Ces étapes produiront des vers adultes propres et vivants qui peuvent être perturbés mécaniquement pour la quantification du contenu bactérien ou utilisés pour d’autres expériences. Ce protocole peut être adapté pour quantifier les bactéries chez les vers colonisés en culture liquide, sur des plaques de gélose, ou à partir de sols naturels ou en microcosme.
- Placer une aliquote de M9TX-01 sur de la glace pour refroidir (4 à 5 fois le nombre d’échantillons en mL).
- Préparez une aliquote de M9TX-01 + eau de Javel (hypochlorite de sodium à 6 %, 1:1000 ou 1:2000 v/v, 1 mL par échantillon + 1 mL supplémentaire) et placez-la sur de la glace pour refroidir.
- Remettre en suspension chaque échantillon de ver dans 1 mL de M9TX-01 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
- Faites tourner brièvement les tubes (2-3 s) dans une minicentrifugeuse à basse vitesse (2 000 x g) à 25 °C pour les adultes en granulés. Pipetez le surnageant et jetez-le, en veillant à ne pas déranger la pastille de ver.
- À l’aide de la centrifugation, rincer les vers deux fois avec 1 mL de M9TX-01, puis une fois avec 1 mL de tampon pour vers de terre M9, afin de réduire les bactéries externes.
- Purgez les bactéries non adhérentes de l’intestin du ver.
- Remettre en suspension chaque échantillon de vers dans 1 mL de milieu S + 2 OP50 tué thermiquement dans un tube de culture.
- Incuber à 25 °C pendant 20 à 30 minutes pour permettre le passage de toute bactérie non adhérente de l’intestin.
NOTE: Cela permettra également de purger toute protéine fluorescente extracellulaire de la lumière et de visualiser plus clairement les bactéries marquées adhérant à l’épithélium intestinal, en particulier lorsque des fluorophores acido-résistants (par exemple, mCherry, dsRed) sont utilisés.
- Blanchissez les vers de surface pour éliminer les bactéries externes.
- Rincer deux fois les vers purgés avec 1 mL de M9TX-01 froid et jeter le surnageant.
- Laisser refroidir les tubes pendant 10 minutes sur de la glace (de préférence) ou à 4 °C. Cela paralysera les vers et empêchera l’ingestion d’eau de Javel.
NOTE: D’autres protocoles utilisent un agent de paralysie chimique tel que le lévamisole ; Il s’agit d’une approche établie qui nécessite l’ajout d’un flux de déchets dangereux. - Ajouter 1 mL de tampon glacé M9 + de l’eau de Javel non parfumée (hydroxyde de sodium à 8,25 %, 1:1000 ou 1:2000 v/v) dans chaque tube. Laisser les tubes reposer sur de la glace (de préférence) ou à 4 °C pendant au moins 10 minutes pour tuer les bactéries externes.
NOTE: Ne dépassez pas une concentration de 1:1000 d’eau de Javel. Même chez les vers paralysés, la mortalité peut en résulter. - Pipeter le tampon d’eau de Javel et le jeter ; Remettez les tubes dans la glace pour vous assurer que les vers ne reprennent pas leur pompage jusqu’à ce que l’eau de Javel soit éliminée.
- Ajouter 1 mL de M9TX-01 froid dans chaque tube. Essorage pendant ~5 s dans une minicentrifugeuse (2 000 x g à 25 °C) ; Remettre les tubes dans la glace. Retirer le surnageant et le jeter.
- Répétez cette étape de rinçage avec 1 autre mL de M9TX-01 froid, en jetant autant de surnageant que possible.