Perturbation mécanique de vers individuels pour évaluer la variabilité des interactions hôte-bactérie

Résumé

Source : Taylor, M. N. et al. Utilisation de données sur un seul ver pour quantifier l’hétérogénéité des interactions entre Caenorhabditis elegans et les bactéries. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre la quantification de la variabilité de la charge bactérienne intestinale chez Caenorhabditis elegans individuel par perturbation mécanique. Il décrit les étapes de préparation des échantillons, de perturbation mécanique, de dilution en série et de comptage des colonies afin d’évaluer les différences de charge bactérienne intestinale entre les vers individuels.

Protocole

1. Séparez les vis sans fin en une plaque profonde de 96 puits avec un grain de carbure de silicium pour les perturbations mécaniques. Préparez la plaque de rupture à 96 puits comme suit.
   1. Procurez-vous une plaque stérile à 96 puits profonds de 2 mL et un couvercle de plaque en silicone à 96 puits correspondant.
      NOTE: Il est important d’utiliser des plaques compatibles avec les adaptateurs à 96 puits pour le perturbateur tissulaire. De minuscules différences dans les dimensions extérieures font la différence entre une plaque qui peut être retirée des adaptateurs et une autre qui ne le peut pas.
   2. À l’aide d’une spatule à cuillère stérile, ajoutez une petite quantité de carbure de silicium stérile de grain 36 dans chaque puits de la plaque qui recevra une vis sans fin. Utilisez suffisamment de sable pour couvrir à peine le fond du puits (environ 0,2 g par puits). En cas d’excès de matériau, il sera difficile de placer une pointe de pipette au fond du puits lors de la récupération du contenu.
   3. Ajouter 180 μL de tampon à vis sans fin M9 dans chaque puits.
   4. Étiquetez les colonnes ou les rangées pour indiquer où chaque échantillon ira, puis recouvrez la plaque sans serrer avec le couvercle de plaque en silicone à 96 puits.
2. Transférez les vers individuels sur la plaque de 96 puits pour la perturbation.
   1. Déplacez les vers perméabilisés avec précaution dans une petite boîte de Pétri (35 ou 60 mm) contenant suffisamment de tampon de vers M9 complété par 0,01 % de Triton X-100 (M9TX-01) pour remplir la boîte à une profondeur de ~1 cm.
      NOTE: Si un grand nombre de vers sont présents, il peut ne pas être possible de transférer l’échantillon entier car le liquide sera encombré et il sera difficile de pipeter des vers individuels.
   2. À l’aide d’un microscope à dissection ou d’un autre appareil à faible grossissement, pipeter des vers individuels dans des volumes de 20 μL et transférer ces vers dans des puits individuels de la plaque de 96 puits.
      NOTE: Il est préférable de ne récolter que des vers fraîchement tués. Évitez les vers de forme rigide et linéaire, car ces vers peuvent être morts depuis un certain temps. Essayez de prendre des vers courbés ou en forme de S, avec une physiologie macroscopique normale et un intestin intact.
   3. Après avoir transféré chaque volume, assurez-vous que le ver sélectionné a bien été éjecté dans le puits. Pour ce faire, pipetez 20 μL de M9TX-01 à partir d’une zone dégagée de la boîte de Pétri et libérez tout le volume dans la boîte ; Celui-ci éjectera normalement la vis sans fin si elle est collée à la pipette. Si le ver était coincé, retirez 20 μL du puits et essayez à nouveau le transfert.
   4. Une fois que tous les vers ont été transférés, couvrez la plaque à 96 puits avec une feuille de film d’étanchéité flexible à dos de papier disponible dans le commerce (2 x 2 carrés), en vous assurant que le côté à dos en papier du film d’étanchéité est orienté vers le bas sur les puits d’échantillon. Veillez à ne pas étirer le film d’étanchéité trop fin, sinon il sera très difficile à retirer plus tard.
   5. Placez légèrement le tapis d’étanchéité en silicone sur le film d’étanchéité flexible ; N’enfoncez pas le couvercle dans les puits à ce moment-là.
   6. Déplacez la plaque à 4 °C pour refroidir pendant 30 à 60 min. Cela évitera la surchauffe pendant la perturbation, ce qui peut endommager les échantillons.
      NOTE: Il s’agit d’un point d’arrêt dans le protocole. Dans la plupart des cas, la plaque peut être laissée à 4°C jusqu’à 4 h avant le broyage. Ne laissez pas les vers toute la nuit, car cela modifierait le nombre de bactéries.
3. Chargez des plaques à 96 puits sur un perturbateur tissulaire pour briser les tissus des vers et libérer les bactéries intestinales.
   REMARQUE : (Facultatif) Si vous utilisez un nombre impair de plaques de 96 puits pour les digestions, il est nécessaire de préparer un contrepoids avant de continuer. Utilisez une plaque vide profonde de 96 puits et remplissez les puits d’eau jusqu’à ce qu’elle pèse le même poids que la première plaque.
   1. Appuyez fermement sur le tapis d’étanchéité en silicone dans les puits pour créer un joint, en vous assurant que le couvercle repose à plat sur toute la surface de la plaque.
      NOTE: Si le film d’étanchéité flexible est trop épais après étirement, il sera difficile de fixer le couvercle en silicone de manière à ce qu’il repose à plat dans tous les puits. Cela se traduira par une étanchéité insuffisante et une contamination de puits à puits pendant l’agitation.
   2. Fixez les plaques dans le perturbateur tissulaire à l’aide des adaptateurs de plaques à 96 puits. Agitez les plaques pendant 1 min à 30 Hz, puis tournez les plaques à 180° et secouez à nouveau pendant 1 min. Cela aidera à assurer une rupture uniforme dans tous les puits de la plaque.
   3. Tapotez fermement les plaques sur le banc deux ou trois fois pour déloger tout grain du film d’étanchéité flexible.
   4. À l’aide d’une grande centrifugeuse équipée de deux adaptateurs de plaques de 96 puits, faites tourner les plaques à 2400 x g pendant 2 minutes pour rassembler tout le matériau au fond des puits.
   5. Retirez le couvercle en silicone et retirez délicatement le film d’étanchéité flexible.
      NOTE: Si le film d’étanchéité flexible colle dans l’un des puits, utilisez une pointe de pipette de 200 μL pour le retirer. Ceci est courant lorsque le film d’étanchéité flexible est étiré trop finement.
4. Diluer en série des échantillons de digestion de vers de terre dans 300 μL dans des plaques de 96 puits.
   1. À l’aide d’une pipette multi-puits réglée à 200 μL, pipetez de haut en bas plusieurs fois lentement et soigneusement pour remélanger le contenu des puits, puis prélevez autant de liquide que possible. Transférez ce liquide dans les rangées supérieures des plaques de 96 puits préparées pour la dilution en série d’échantillons de vers perturbés.
   2. À l’aide d’une pipette de 96 puits réglée à 20 μL, prélevez ce volume de liquide de la rangée supérieure et distribuez-le dans la rangée B. Pipetez vers le haut et vers le bas 8 à 10 fois pour mélanger. Jetez les embouts.
   3. Répétez l’étape 4.2, en commençant par les échantillons 0,1x de la rangée B pour créer des échantillons de dilution 0,01x dans la rangée C.
   4. Répétez l’étape 4.2 à nouveau, en allant de la rangée C à la rangée D.
   5. Déposer sur une gélose solide pour la quantification bactérienne. Pour les vers monocolonisés, il suffit généralement de plaquer 10 à 20 gouttes de chaque dilution [1x-0,001x] sur des plaques de gélose. Pour la colonisation multi-espèces, plaquer chaque dilution séparément en pipetant 100 μL sur une plaque de gélose de 10 cm ; Étalez immédiatement à l’aide de billes de placage de verre.

Matériaux