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1. Quantification de la localisation polaire et de la dynamique des composantes dot/icm
NOTE: Les étapes suivantes sont conçues pour les images avec 0,129 μm par pixel qui ont été acquises avec un binning 2 x 2.
- Quantification de la polarité des protéines de fusion sfGFP (superfolder green fluorescent protein) (Figure 1)
- Ajustez le contraste de l’image pour que les bactéries soient clairement visibles. À l’aide de l’outil Région, placez un rectangle de 0,25 x 1,3 μm2 commençant au pôle et s’étendant dans le cytoplasme. Le rectangle doit rester précisément à l’intérieur des limites bactériennes.
- Marquez au moins 200 bactéries et utilisez le bouton Région à masquer pour créer des masques pour les régions d’intérêt. Sous Statistiques du masque et Étendue du masque, choisissez Objet. Ensuite, sous Caractéristiques et intensité, marquez Intensité moyenne et variance.
- Exportez les données et calculez les scores de polarité de chaque bactérie en tant que rapport entre la variance et l’intensité moyenne.
- Pour les applications à haut débit, utilisez un objectif de phase et une configuration de condenseur appropriée pour acquérir des images avec la phase et les canaux 488 nm. Assurez-vous de choisir des champs de vision où les bactéries sont complètement séparées.
- Ajustez le contraste du canal de phase de l’image à un niveau où les bactéries sont clairement visibles. Ouvrez l’image à deux canaux, lancez la fenêtre Créer un masque de segment et passez le canal en phase.
- Ajustez un seuil approprié et supprimez les petits objets à l’aide du bouton Définir les objets . Sous Affiner le masque, choisissez Supprimer les objets Edges, puis séparez les masques de bactéries adjacents les uns aux autres.
- Calculez les scores de polarité du signal dans le canal 488 pour chaque cellule, comme décrit précédemment aux étapes 1.1.2 à 1.1.3.
- Quantification de la dynamique des protéines de fusion sfGFP (Figure 2)
NOTE: La dynamique est définie comme des changements d’intensité au fil du temps, et les étapes suivantes sont conçues pour de courtes périodes d’imagerie (c’est-à-dire plusieurs minutes). Ajoutez au tampon les suppléments appropriés si des périodes d’imagerie plus longues sont souhaitées.- Dans la fenêtre Capture d’image , marquez Timelapse, entrez le temps des intervalles dans la zone intervalle et entrez 2 dans la zone # de points temporels . Acquérir deux images successives de Legionella pneumophila exprimant la protéine fluorescente d’intérêt.
- Ajustez le contraste de l’image jusqu’à ce que les cellules soient clairement visibles. Suivez la figure 2A et les descriptions ci-dessous pour placer trois masques différents. Utilisez l’outil Région pour placer un carré de 0,25 x 0,25 μm au milieu d’au moins 400 cellules.
- Utilisez le bouton Région à masquer pour créer un masque (masque 1) des carrés d’intérêt. Créez un nouveau masque vide (masque 2) et utilisez l’outil pixel ou l’outil polygone pour marquer la zone entière de la cellule d’au moins 25 cellules aléatoires, qui seront utilisées pour calculer le blanchiment de fluorescence. Créez un nouveau masque vide (masque 3) et utilisez le grand outil pinceau pour marquer les zones entre les cellules, qui seront utilisées pour la soustraction de l’arrière-plan.
- Sous Statistiques du masque et Portée du masque, choisissez Objet pour le masque 1 et le masque 2. Ensuite, sous Caractéristiques et intensité, choisissez Intensité moyenne et exportez les données des deux masques. Pour le masque 3, exportez l’intensité moyenne de l’ensemble du masque.
- Calculez la variation de l’intensité de fluorescence pour chaque objet du masque 1 à l’aide des formules suivantes :
où le masque 1 est un carré de 0,25 μm × 0,25 μm placé au centre de la cellule, le masque 2 couvre toute la cellule, le masque 3 est l’arrière-plan entre les cellules, T1 est l’intensité moyenne au premier point temporel et T2 est l’intensité moyenne au deuxième point temporel.
