Préparation de Legionella pneumophila pour la tomographie électronique cryogénique

Résumé

Source : Chetrit, D., et al. Application de l’imagerie de cellules vivantes et de la cryo-tomographie électronique pour résoudre les caractéristiques spatio-temporelles du système de sécrétion Dot/Icm de Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020)

La vidéo décrit comment préparer des échantillons de Legionella pneumophila pour la cryotomographie électronique en combinant la culture bactérienne, le marquage de nanoparticules d’or et les techniques de vitrification. Le processus préserve les structures cellulaires natives et permet l’imagerie à haute résolution des composants du système de sécrétion associés à la membrane.

Protocole

1. Détection de la masse volumique sfGFP avec Cryo-ET

1. Préparation de l’échantillon, collecte des données et reconstruction

1. Cultiver une plaque lourde de Legionella pneumophila exprimant une protéine Dot/Icm marquée par fluorescence sur des plaques CYE-agar-streptomycine pendant 48 heures à 37 °C. Remettre les cellules en suspension dans ddH₂O à une DO₆₀₀ de 0,7. Ajouter 5 μL de particules d’or colloïdal (BSA Tracer, 10 nm) à 20 μL de suspension cellulaire.

2. Pipeter 5 μL du mélange de cellules sur une grille de carbone trouée fraîchement déchargée (R 2/1 sur une maille Cu 200) et laisser reposer pendant 1 min. Éponger avec du papier filtre et congeler dans de l’éthane liquide à l’aide d’un appareil à piston entraîné par gravité.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Particules d’or colloïdal de 10 nm	Aurion	25486
100x Objectif Plan Apo (1.4 NA)	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
Appareil photo numérique monochrome CoolSNAP EZ 20 MHz	Photométrie
Cadre Gene, 1,7 x 2,8 cm, 125 μL	Fisher Scientific	AB-0578
Holey Grille en carbone R 2/1 Cu 200 mesh	Quantifoil	Q225-CR1
Nitrate de fer(III) non ahydraté	Sigma-Aldrich	216828
Caméra K2 Summit pour cryo-EM	GATAN
Lames de couverture de microscope 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Lames de couverture de microscope 24x50 mm	Fisher Scientific	12 à 545 K
Lames de microscope 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
Diaporama 6.0	Innovations en matière d’imagerie intelligente
Moteur léger Spectra X	Lumencor