Culture de la bactérie Vibrio natriegens à croissance rapide

Résumé

Source : Wiegand, D. J., Lee, et al., Expression de protéines acellulaires à l’aide de la bactérie à croissance rapide Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la culture et la récolte de Vibrio natriegens, une bactérie à croissance rapide, dans des conditions aérées pour préparer des granulés bactériens pour la production d’extraits bruts.

Protocole

Préparation de l’extrait de cellules brutes de Vibrio natriegens – Culture bactérienne

1. Préparez le milieu de croissance bactérienne de V. natriegens LB-V2 (bouillon de lysogénie avec sels V2) conformément au tableau 1. Stérilisez le milieu de culture par autoclavage. Laissez le support atteindre la température ambiante (RT). Stockez le support excédentaire sur RT.
   PRUDENCE: Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié et consultez les instructions spécifiques au laboratoire lorsque vous utilisez un autoclave.
2. Utilisez un stock de glycérol de V . natriegens de type sauvage pour inoculer 3 mL de milieu LB-V2. Cultiver toute la nuit à 30 °C en secouant à 225 tr/min.
3. Laver 1 mL de la culture de nuit par centrifugation à 10 600 x g sur une centrifugeuse de paillasse pendant 1 min. Aspirer le surnageant sans perturber la pastille résultante et remettre en suspension dans 1 mL de milieu LB-V2 frais.
4. Dans un erlenmeyer autoclavé de 4 L avec couvercle stérile, ajoutez 1 L de milieu de croissance frais LB-V2. Inoculer à l’aide de 1 mL de culture de nuit lavée (rapport de dilution de 1:1 000). Cultivez la culture à 30 °C en secouant à 225 tr/min.
   REMARQUE : Les cultures de V. natriegens peuvent être augmentées ou réduites tout en maintenant le rapport de dilution de 1:1 000. Par exemple, ajouter 250 μL de culture de nuit lavée à 250 mL de milieu de culture frais LB-V2 dans un erlenmeyer à chicanes de 2 L avec un couvercle stérile.
5. Surveiller la DO₆₀₀ de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque la culture atteint une DO_{de 600} = 1,0 ± 0,2, récoltez la culture par centrifugation à 3 500 x g pendant 20 min à 4 °C. Placez les granulés sur de la glace.
   REMARQUE : V. natriegens se développe rapidement, il est donc nécessaire de surveiller de près la culture. La croissance jusqu’à₆₀₀ DO = 1,0 devrait prendre environ 1,5 à 2 h avec un rapport de dilution de 1:1 000.
6. Aspirez le surnageant et stockez immédiatement la pastille bactérienne résultante à -80 °C ou procédez directement à la lyse cellulaire.
   NOTE: Cette étape est un bon point d’arrêt ; Cependant, il est recommandé de traiter le granulé immédiatement ou dans un délai de 1 à 2 jours pour de meilleurs résultats.

Tableau 1 : Réactifs pour la préparation de 1 L de milieu de croissance bactérienne LB-V2

Tableau 1 A	Préparation du milieu de croissance bactérienne LB-V2
Composant	Quantité (g)	Concentration finale (mM)	Volume final (L)
Bouillon LB (Miller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Tableau 1 B	Préparation du tampon de lyse S30A
Composant	Quantité (g)	Concentration finale (mM)	Volume final (L)
Solution de tris (pH 8,0) - 1 M (mL)	25	50	0.5
Mg-glutamate	2.72	14
K-glutamate	6.10	60
Dithiothréitol (DTT) - 1 M (mL)	1	2

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de 2 mL	Eppendorf	22363352
HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique)	Sigma	N° H3375
LB (Luria-Bertani) Bouillon (Meunier)	Sigma	N° L3522
Chlorure de magnésium (MgCl₂)	Sigma	Référence M8266
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma	P9333
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma	Réf. S7653
Solution de tris (pH 8,0) - 1 m	Invitrogen	AM9856
Vibrio natriegens (type sauvage) Stock lyophilisé	ATCC	14048