Préparation de l’extrait de cellule brute de Vibrio natriegens

Résumé

Source : Wiegand, D. J., et al. Expression de protéines acellulaires à l’aide de la bactérie à croissance rapide Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo montre la préparation d’un extrait cellulaire de Vibrio natriegens, une bactérie à croissance rapide connue pour son taux élevé de synthèse des protéines. La pastille bactérienne est lavée et remise en suspension dans un tampon de lyse avant d’être sonicationnée sur de la glace pour éviter la dégradation cellulaire. Le lysat est centrifugé pour séparer les débris cellulaires insolubles, et l’extrait cellulaire est recueilli, congelé et stocké pour une utilisation future.

Protocole

1. Préparation des extraits de cellules brutes de V. natriegens – Culture bactérienne

1. Préparer le milieu de croissance bactérienne de V. natriegens , bouillon de lysogénie version 2 (LB-V2) conformément au tableau 1. Stérilisez le milieu de culture par autoclavage. Laissez le support atteindre la température ambiante (RT). Stockez le support excédentaire sur RT.
   PRUDENCE: Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié et consultez les instructions spécifiques au laboratoire lorsque vous utilisez un autoclave.
2. Utilisez un stock de glycérol de V . natriegens de type sauvage pour inoculer 3 mL de milieu LB-V2. Cultiver toute la nuit à 30 °C en secouant à 225 tr/min.
3. Laver 1 mL de la culture de nuit par centrifugation à 10 600 x g sur une centrifugeuse de paillasse pendant 1 min. Aspirer le surnageant sans perturber la pastille résultante et remettre en suspension dans 1 mL de milieu LB-V2 frais.
4. Dans un erlenmeyer autoclavé de 4 L avec un couvercle stérile, ajouter 1 L de milieu de croissance frais LB-V2. Inoculer à l’aide de 1 mL de culture de nuit lavée (rapport de dilution de 1:1 000). Cultivez la culture à 30 °C en secouant à 225 tr/min.
   REMARQUE : Les cultures de V. natriegens peuvent être augmentées ou réduites tout en maintenant le rapport de dilution de 1:1 000. Par exemple, ajouter 250 μL de culture de nuit lavée à 250 mL de milieu de culture frais LB-V2 dans un erlenmeyer à chicanes de 2 L avec un couvercle stérile.
5. Surveiller la DO₆₀₀ de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque la culture atteint_{une DO de 600} = 1,0 ± 0,2, récolter la culture par centrifugation à 3 500 x g pendant 20 min à 4 °C. Placer les granulés sur de la glace.
   REMARQUE : V. natriegens se développe rapidement, il est donc nécessaire de surveiller de près la culture. La croissance jusqu’à₆₀₀ DO = 1,0 devrait prendre environ 1,5 à 2 h avec un rapport de dilution de 1:1 000.
6. Aspirer le surnageant et stocker immédiatement la pastille bactérienne résultante à -80 °C ou procéder directement à la lyse cellulaire décrite dans la rubrique 2.
   NOTE: Cette étape est un bon point d’arrêt ; Cependant, il est recommandé de traiter le granulé immédiatement ou dans un délai de 1 à 2 jours pour de meilleurs résultats.

2. Préparation des extraits de cellules brutes de V. natriegens – lyse cellulaire

1. Préparer le tampon de lyse S30 conformément au tableau 1 dans de l’eau désionisée stérile (DI) et ajuster le pH à 7,7 à l’aide d’acide acétique glacial.
   PRUDENCE: L’acide acétique glacial doit être manipulé avec un EPI approprié lors de l’ajustement du pH.
2. Refroidissez le tampon de lyse S30 à environ 4 °C dans un réfrigérateur ou sur de la glace avant de commencer la procédure de lyse cellulaire.
   NOTE: Pour un refroidissement rapide, le tampon de lyse peut être placé à -20 °C. Ne laissez pas la mémoire tampon se figer.
3. Placez les granules de cellule sur de la glace pendant 10 à 20 minutes ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement décongelées. Remettre en suspension toutes les pastilles résultant de la même culture de 1 L à l’aide de 10 mL de tampon de lyse S30 froid, puis transférer la suspension dans un tube de 50 mL. Si les granulés ne sont pas congelés au congélateur à -80 °C à l’étape 1.6, passez directement à la remise en suspension.
   NOTE: Augmentez le volume de tampon de lyse S30 utilisé pour remettre les granulés en suspension au besoin.
4. Suspension centrifugeuse à 3 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnageant sans perturber la pastille. Lavez la pastille une deuxième fois à l’aide de 10 mL de tampon de lyse S30 froid. Placez la pastille sur de la glace.
5. Dans une chambre froide, ajoutez 500 μL de tampon de lyse S30 froid à la pastille dans le tube de 50 mL. À l’aide d’une pointe de pipette à large diamètre, remettez la pastille en suspension et transférez soigneusement toute la suspension de pastilles dans un tube de 2 ml.
   NOTE: Si vous n’avez pas de pipette à gros calibre, utilisez une paire de ciseaux pour couper l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 ml afin d’augmenter l’alésage pour le transfert des granulés.
   1. Transférez autant de granulés que possible sans augmenter considérablement le volume ; cependant, la pastille doit être remise en suspension dans un liquide suffisant pour être soniquée, comme l’indique une suspension homogène dans le tube de 2 mL. Ne remplissez pas trop le tube de 2 ml. La suspension ne doit pas dépasser 1,5 mL ; Divisez-le en plusieurs tubes si nécessaire.
6. Gardez la pastille de cellule sur de la glace et faites-la travailler dans une chambre froide. Remplissez un bécher de 600 ml de glaçons et placez un porte-tube de 2 ml sur la glace.
   NOTE: Il est utile de placer le support de tube près du bécher, de sorte que la suspension de la pastille soit visible dans la glace pour surveiller la progression de la sonication (voir Figure 1).
7. Vortex suspendez brièvement les pastilles dans un tube de 2 ml pour homogénéiser les cellules, effleurez les tubes pour retirer toutes les cellules au bas du capuchon et placez-les dans le support de tube avec le capuchon ouvert. Abaissez l’embout du sonicateur dans la suspension de manière à ce qu’il se trouve juste sous la surface du liquide.
8. Préparez la configuration de sonication comme illustré à la figure 2 à l’aide d’un sonicateur et d’une sonde avec un diamètre d’extrémité de 1/8 de pouce. Entrez les paramètres suivants dans la commande du sonicateur : fréquence de 20 kHz et amplitude de 50 %, temps d’activation de l’impulsion : 10 s, temps d’arrêt de l’impulsion : 60 s.
9. Exécutez le protocole de sonication par impulsions pendant trois cycles. Si le volume total de la suspension de pastilles est > 500 μL, exécutez le protocole de sonication par impulsions six fois.
   NOTE: En général, 3 à 6 impulsions sont suffisantes pour lyser les pastilles de V. natriegens  ; Des impulsions supplémentaires peuvent être nécessaires en fonction du sonicateur. Pendant la sonication, utilisez la plate-forme du bouton de réglage pour déplacer la sonde de haut en bas afin de lyser toute pastille qui aurait pu se déposer au fond du tube. Le tube peut être retiré du support et brièvement vortex pour réhomogénéiser la suspension entre les impulsions.
   PRUDENCE: Portez une protection auditive appropriée lorsque le sonicateur est actif.
10. Après sonication, centrifuger l’extrait brut à 16 000 x g pendant 30 à 45 minutes à 4 °C ou jusqu’à ce que le lysat soit exempt de tout débris cellulaire, comme illustré à la figure 3.
11. Dans une chambre froide, aliquote 50 μL des surnageants obtenus dans de nouveaux tubes de 2 mL sans perturber la pastille.
    NOTE: Tout débris transféré accidentellement dans les nouveaux tubes de 2 mL réduira considérablement la capacité de l’extrait à synthétiser des protéines à haut rendement.
12. La cellule de congélation instantanée extrait le brut en plaçant les tubes dans un support de tube muni d’une corde de trempage, comme le montre la figure 4. Immergez les tubes dans un Dewar contenant de l’azote liquide et placez-les immédiatement dans un congélateur à -80 °C jusqu’à utilisation. PRUDENCE: Utilisez l’EPI approprié pour la manipulation de l’azote liquide, y compris une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité, un écran facial, un tablier cryogénique et des gants.

Tableau 1 : Réactifs pour la préparation de 1 L de milieu de croissance bactérienne LB-V2 et de 0,5 L de tampon de lyse cellulaire S30A.

Tableau 1 A	Préparation du milieu de croissance bactérienne LB-V2
Composant	Quantité (g)	Concentration finale (mM)	Volume final (L)
Bouillon LB (Miller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Tableau 1 B	Préparation du tampon de lyse S30A
Composant	Quantité (g)	Concentration finale (mM)	Volume final (L)
Solution de Tris (pH 8,0) - 1 M (mL)*	25	50	0.5
Mg-glutamate	2.72	14
K-glutamate	6.10	60
Dithiothréitol (DTT) - 1 M (mL)*	1	2

Résultats

Figure 1 : Vue rapprochée du bécher et du support de tube sur la plate-forme de sonication.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de 15 mL	Corning	352196
Tubes de 2 mL	Eppendorf	22363352
Tubes de 50 mL	Corning	352070
Fiole de Dewar - 4L	ThermoScientific	10-194-100C
Acide L-glutamique sel hémimagnésien tétrahydraté	Sigma	49605
Sel de potassium de l’acide L-glutamique monohydraté	Sigma	G1149
Bouillon LB (Miller)	Sigma	N° L3522
Chlorure de magnésium (MgCl₂)	Sigma	Référence M8266
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma	P9333
Granulés d’hydroxyde de potassium	Sigma/Roche	1050121000
Sonicateur Q125 et sonde CL-18	Qsonica	4422
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma	Réf. S7653
Vibrio natriegens (type sauvage) Stock lyophilisé	ATCC	14048