Expression de protéines acellulaires à l’aide d’un extrait de cellules brutes bactériennes

Résumé

Source : Wiegand, D. J., et al. Expression de protéines acellulaires à l’aide de la bactérie à croissance rapide Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo démontre l’utilisation d’un système d’expression de protéines acellulaires bactériennes basé sur le lysat brut de Vibrio natriegens pour effectuer une transcription et une traduction in vitro couplées. Il met en évidence la préparation d’un master mix avec des composants essentiels et la synthèse étape par étape de protéines fonctionnelles à partir d’un modèle d’ADN.

Protocole

1. Préparation des composants de la réaction acellulaire

1. Composants généraux de la réaction
   1. Préparer des stocks de travail de Mg-glutamate et de K-glutamate dans des tubes de 50 mL avec de l’eau DI stérile (désionisée) à des concentrations de 100 mM et 2000 mM, respectivement.
   2. Préparez une couche de travail composée à 50 % (p/v) de polyéthylène glycol (PEG)-8000 en ajoutant 100 ml d’eau stérile DI dans un bécher de 250 ml. Placez un petit agitateur magnétique dans le bécher. Pesez 50 g de PEG-8000 et ajoutez-le aux 100 ml d’eau dans le bécher.
   3. Placez le bécher sur une plaque d’agitation chauffée réglée à 100 °C et remuez à 250 tr/min jusqu’à ce que le PEG-8000 soit en solution. Laisser refroidir le mélange liquide PEG-8000 avant de le transférer dans des tubes de 50 ml.
2. Master mix de solutions énergétiques
   1. Préparez une solution de 5 M de KOH en ajoutant 140 g de pastilles de KOH à 500 ml d’eau DI stérile.
      PRUDENCE: Préparez cette solution dans une cagoule chimique et portez un EPI lorsque vous manipulez des bases solides. La solution deviendra chaude, de sorte que le bouchon de la bouteille doit être desserré pour éviter l’accumulation de pression. Laissez la solution KOH atteindre RT avant de l’utiliser.
   2. Préparez un tampon HEPES-KOH de 1750 mM en ajoutant 20,85 g de HEPES dans une bouteille de 100 mL. Ajouter lentement de l’eau DI stérile jusqu’à ce que le volume atteigne 40 ml. Bouteille vortex pour dissoudre le HEPES. Utilisez la solution de KOH à 5 M pour ajuster le pH à 8,0, puis portez le volume de la solution à 50 mL.
      PRUDENCE: Le KOH doit être manipulé avec un EPI approprié lors de l’ajustement du pH.
   3. Préparez les composants de base restants du mélange maître énergétique 10x aux concentrations indiquées dans le tableau 1 dans de l’eau DI stérile et placez chaque stock sur de la glace. Décongeler les stocks de 100 mM ATP, GTP, CTP et UTP à RT et les placer sur la glace.
      NOTE: Un thermomélangeur réglé à 37 °C et 350 tr/min peut être utilisé pour dissoudre les réactifs dans la solution si nécessaire. Ne surchauffez pas et ne laissez pas de réactifs sur le thermomélangeur pendant une période prolongée.
   4. Dans un tube de 15 ml, ajouter chaque composant du mélange maître de solution énergétique conformément à l’ordre et au volume indiqués au tableau 1. Vortex la solution après l’ajout de chaque composant. Cela fera 5 ml de mélange maître de solution énergétique 10x.
   5. Divisez le mélange maître de solution énergétique 10x en aliquotes de 200 μL dans des tubes de 2 mL. Congeler chaque aliquote. Placez-les immédiatement dans le congélateur à -80 °C jusqu’à utilisation.
3. Master mix d’acides aminés
   1. Pour préparer un mélange maître frais 4x acides aminés, commencez par décongeler chaque stock d’acides aminés à RT, puis placez-le sur de la glace. Utilisez un vortex et/ou un thermomélangeur réglé à 37 °C et 350 tr/min pour vous assurer que tous les stocks d’acides aminés sont complètement dissous.
      NOTE: La cystéine peut ne pas se dissoudre complètement ; Il peut être ajouté au Master Mix d’acides aminés sous forme de suspension. Ne surchauffez pas et ne laissez pas de réactifs sur le thermomélangeur pendant une période prolongée.
   2. Dans un tube de 15 ml, ajoutez le volume approprié d’acides aminés à de l’eau DI stérile de sorte que la concentration finale de chacun soit de 8 mM dans l’ordre suivant : ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU et CYS. Après avoir ajouté chaque acide aminé, vortex la solution de mélange principal. Les volumes indiqués dans le tableau 1 représenteront 2,4 mL de mélange maître d’acides aminés.
   3. Divisez le mélange maître 4x acides aminés en 200 μL d’aliquotes dans des tubes de 2 mL. Congeler chaque aliquote. Placer immédiatement au congélateur à -80 °C jusqu’à utilisation.
4. Production d’une matrice d’ADN plasmidique prête à réagir
   NOTE: L’expression des protéines acellulaires dans ce système a été optimisée à l’aide du vecteur d’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) T7-pJL1-sfGFP (Table of Materials). Il est recommandé d’utiliser ce plasmide comme contrôle de l’efficacité de la réaction acellulaire et le squelette pJL1 pour le clonage et l’expression d’autres séquences protéiques. D’autres matrices d’ADN plasmidique peuvent être utilisées ; cependant, il est important de noter que la transcription est contrôlée par une séquence promotrice T7 et la présence de l’ARN polymérase T7. Un protocole simple pour la production à grande échelle de n’importe quelle matrice d’ADN plasmidique à partir d’E. coli transformé est décrit ci-dessous.
   1. Purifiez le vecteur souhaité à l’aide d’un kit de purification de plasmide selon les instructions du fabricant (Table des matériaux). REMARQUE : Il est recommandé de concentrer autant que possible la matrice d’ADN plasmidique pour répondre aux contraintes de volume serrées de la réaction acellulaire. En général, visez une masse d’œuvre de 750 à 1500 ng/μL.

2. Réalisation de réactions d’expression de protéines acellulaires à l’aide de l’extrait brut de V. natriegens

1. Expression de protéines acellulaires à l’aide d’un plasmide ou d’un modèle d’ADN linéaire
   1. Retirer 10 aliquotes de mélange maître de solution énergétique et 4 aliquotes de mélange maître d’acides aminés du congélateur à -80 °C, décongeler à RT et placer sur de la glace. Retirez les stocks d’ARN polymérase T7 et d’inhibiteur de RNase du congélateur à -20 °C et placez-les sur de la glace. Décongelez le modèle d’ADN à RT et placez-le sur de la glace.
   2. Préparez un mélange maître de réaction acellulaire conformément au tableau 2 en ajoutant chaque composant dans l’ordre suivant dans un tube de 2 mL sur de la glace : mélange maître d’acides aminés, mélange maître de solution énergétique, Mg-glutamate, K-glutamate, matrice d’ADN, PEG-8000, ARN polymérase T7 et inhibiteur de la RNase. Agitez doucement le tube après chaque ajout au mélange principal.
      NOTE: Si une matrice linéaire doit être utilisée pour l’expression de protéines acellulaires, ajoutez 5 à 10 fois plus de matériau que la matrice plasmidique pour obtenir des rendements appréciables de protéines.
   3. Retirez le lysat de cellules brutes de V. natriegens des congélateurs à -80 °C et placez-le sur de la glace pendant 10 à 20 minutes jusqu’à ce qu’il soit décongelé. Ajouter le volume approprié d’extrait brut de cellule au mélange maître de réaction acellulaire conformément au tableau 2 et mélanger doucement en effleurant ou en pipetant de haut en bas.
   4. Point final d’expression de protéines acellulaires à l’aide d’un thermocycleur
      1. Pipetez 10 μL du mélange maître de réaction acellulaire au fond d’une plaque de PCR à 96 ou 384 puits. Entre chaque transfert sur la plaque PCR, mélangez le mélange principal en effleurant doucement le tube.
         NOTE: Le mélange maître de réaction acellulaire doit être bien mélangé en tout temps pour maximiser la reproductibilité de la réaction et l’expression des protéines acellulaires dans tous les échantillons.
   5. Centrifugez brièvement la plaque à 1 000 x g pendant 10 s pour regrouper tout mélange maître qui aurait pu se coincer sur les côtés des puits. Scellez les puits avec un adhésif pour plaque pour éviter l’évaporation, puis placez la plaque PCR dans un thermocycleur réglé à 26 °C avec un couvercle chauffant réglé à 105 °C.
      NOTE: La répartition uniforme de la chaleur et le couvercle chauffant d’un thermocycleur améliorent considérablement les rendements d’expression des protéines.
   6. Incuber les réactions acellulaires pendant au moins 3 h. Après l’incubation, les protéines exprimées peuvent être purifiées, quantifiées et utilisées pour les processus en aval.
      NOTE: Les protéines exprimées peuvent être directement quantifiées dans la réaction acellulaire à l’aide d’une méthode au choix de l’utilisateur. Par exemple, les protéines fluorescentes peuvent être quantifiées à l’aide d’une courbe standard externe, ou la radioactivité peut être mesurée si l’on utilise un acide aminé radiomarqué dans la réaction acellulaire. La spectroscopie UV-visible ou les dosages de protéines totales ne sont généralement pas recommandés pour mesurer directement la production de protéines dans des réactions acellulaires sans purification initiale.

Tableau 1 : Réactifs pour la préparation de 5 mL de mélange maître de solution énergétique 10x et de 2,4 mL de mélange maître d’acides aminés 4x.

Préparation du Master Mix
Composant	Concentration du stock (mM)	Concentration finale (mM)	Quantité (μL)	Volume final (μL)
HEPES-KOH pH 8	1750	500	1428.57	5000
ATP	100	15	750.00
GTP	100	15	750.00
CTP	100	9	450.00
UTP	100	9	450.00
ARNt d’E. coli MRE 600 (mg/mL)*	100	2	100.00
Coenzyme A Hydrate	200	2.6	65.00
NAD	200	3.3	82.50
camp	650	7.5	57.69
Acide folinique	100	0.7	35.00
Spermidine	1600	10	31.25
3-PGA	2000	300	750.00
Eau déminéralisée stérile			49.99
	Préparation de 4x Amino Acid Master Mix
Composant	Concentration du stock (mM)	Concentration finale (mM)	Quantité (μL)	Volume final (μL)
ALA	168	8	114.3	2400
ARG	168	8	114.3
ASN	168	8	114.3
ASPIC	168	8	114.3
GLN	168	8	114.3
GLU	168	8	114.3
GLY	168	8	114.3
SON	168	8	114.3
IIE	168	8	114.3
LYS	168	8	114.3
RENCONTRÈRENT	168	8	114.3
PHE	168	8	114.3
PRO	168	8	114.3
SER	168	8	114.3
THR	168	8	114.3
VAL	168	8	114.3
TRP	168	8	114.3
TYR	168	8	114.3
LEU	140	8	137.1
CYS	168	8	114.3
Eau déminéralisée stérile			91.4

10x Energy Solution

Tableau 2 : Composants du mélange maître de réaction acellulaire optimisé de V. natriegens pour la matrice d’ADN

Master Mix de réaction acellulaire
Composant	Concentration du stock (mM)	Concentration finale (mM)	Quantité (μL) 1x Réaction	Quantité (μL) 50x Réactions
Extrait ( %)		25	2.50	125.00
Mg-glutamate	100	3.5	0.35	17.50
K-glutamate	2000	80	0.40	20.00
4x Master Mix d’acides aminés	8.0	2	2.50	125.00
10x Master Mix de solution énergétique			1.00	50.00
ADN plasmidique (ng/μL)	1000	500	0.50	25.00
50 % PEG-8000 ( %)	50	2	0.40	20.00
ARN polymérase T7			1.00	50.00
Inhibiteur de la RNase, murin			0.10	5.00
Eau déminéralisée stérile			1.25	62.50
Volume de réaction (μL) :	10

Matériaux