Surveillance en temps réel de la croissance bactérienne à l’aide d’un système de culture microfluidique de microgouttelettes

Résumé

Source : Jian, X. et. al., Culture microbienne automatisée et évolution adaptative à l’aide du système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC). J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre l’utilisation d’une plateforme à base de gouttelettes microfluidiques pour la surveillance en temps réel de la croissance bactérienne. En générant des gouttelettes uniformes contenant des suspensions bactériennes et en les guidant à travers une voie de détection, le système permet une mesure optique continue de la densité cellulaire pour construire une courbe de croissance.

Protocole

1. Préparatifs

1. Branchez l’aiguille de la seringue (le diamètre intérieur est de 0,41 mm et le diamètre extérieur est de 0,71 mm), le connecteur rapide A et le flacon de réactif (Figure 1C), puis autoclavez-les à 121 °C pendant 15 min.
   NOTE: Dévissez légèrement le bouchon du flacon de réactif pendant la stérilisation. Quelques flacons de réactifs supplémentaires peuvent être préparés à chaque fois pour l’utilisation.
2. Utilisez un filtre au fluorure de polyvinylidène (PVDF) de 0,22 μm pour filtrer l’huile du système de culture de microgouttelettes (MMC). Placez à l’avance la puce microfluidique (Figure 1B) et l’huile MMC dans la paillasse propre et stérilisez-les par irradiation ultraviolette pendant 30 min avant de les utiliser.
   NOTE: Pour plus de détails sur le connecteur rapide A, la bouteille de réactif, l’huile MMC et la puce microfluidique, reportez-vous à la table des matériaux.
3. Installer la puce microfluidique
   1. Ouvrez la porte de la chambre de commande (Figure 1A) et soulevez la sonde à fibre optique.
   2. Alignez les trous du champ électrique avec les aiguilles du champ électrique et placez délicatement la puce sur le socle de la puce. Insérez ensuite les deux colonnes de positionnement dans les trous de positionnement et posez la sonde à fibre optique (Figure 1D).
   3. Connectez le connecteur rapide A de la puce au port correspondant de la MMC en fonction du numéro de position (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Fermez ensuite la porte de la chambre d’opération.
4. Faites le plein d’huile MMC (à environ 80 ml) dans la bouteille d’huile et videz les déchets liquides dans la bouteille avant utilisation.
   NOTE: Les déchets liquides sont généralement des déchets organiques. Veuillez vous référer à la loi et à la réglementation régionales lors de l’élimination, sous réserve de modifications en fonction de la configuration expérimentale.

2. Mesure de la courbe de croissance dans MMC

1. Préparation de la solution bactérienne initiale
   1. Suivez les réglementations standard en vigueur pour préparer le milieu Luria-Bertani (LB) et l’autoclave à 121°C pendant 15 min.
      NOTE: Composants du milieu LB : NaCl (10 g/L), extrait de levure (5 g/L) et tryptone (10 g/L).
   2. Retirer la souche MG1655 d’Escherichia coli (E. coli) de son stock de glycérol et la cultiver dans une fiole agitée de 50 mL avec 10 mL de milieu LB dans un incubateur à agitation (200 tr/min) à 37 °C pendant 5 à 8 h.
      NOTE: Le temps de culture dépend des souches spécifiques. Il est optimal de cultiver la souche dans la période/phase logarithmique.
   3. Diluer la solution cultivée d’E. coli MG1655 avec un milieu frais jusqu’à une densité optique à 600 nanomètres (DO₆₀₀) de 0,05-0,1 pour obtenir une première solution bactérienne (préparer environ 10 ml).
2. Cliquez sur Initialisation pour initialiser la MMC. Une fois l’interface d’initialisation affichée, réglez la température de culture sur 37 °C et la valeur du signal photoélectrique sur 0,6 (Figure 2A). L’initialisation prendra environ 20 minutes.
3. Allumez la lampe ultraviolette (UV) (longueur d’onde 254 nm) lors de l’initialisation.
4. Injectez la solution bactérienne initiale et l’huile MMC dans le flacon de réactif.
   1. Sortez un flacon de réactif stérilisé sur la paillasse propre et serrez le bouchon.
   2. À l’aide d’une seringue stérile de 10 ml, injectez 3 à 5 ml d’huile MMC à partir de l’aiguille de la seringue du tube latéral. Inclinez et tournez lentement le flacon de réactif pour que l’huile s’infiltre complètement dans la paroi intérieure.
   3. Injectez environ 5 ml de solution bactérienne initiale, puis remplissez le flacon de réactif en injectant à nouveau 5 à 7 ml d’huile.
   4. Retirez le connecteur rapide indépendant A et insérez le connecteur rapide A du flacon de réactif dans son connecteur rapide B pour terminer l’opération d’injection d’échantillon (Figure 3A).
5. Attendez la fin de l’initialisation, puis éteignez la lampe UV (longueur d’onde 254 nm).
6. Ouvrez la porte de la chambre d’opération et placez le flacon de réactif dans le bain métallique.
7. Retirez le connecteur C2 de la puce et le connecteur rapide A de la bouteille de réactif. Connectez le connecteur du tube latéral de la bouteille de réactif au connecteur C2 et le connecteur du tube supérieur au connecteur O2. Fermez ensuite la porte de la chambre d’opération.
8. Cliquez sur Courbe de croissance pour choisir la fonction de mesure de la courbe de croissance (Figure 2A). Dans l’interface de réglage des paramètres, entrez le nombre 15, activez le commutateur de détection OD et réglez la longueur d’onde sur 600 nm. Cliquez sur Démarrer pour démarrer la génération de gouttelettes. Cela prendra environ 10 minutes. NOTE: Ici, le nombre fait référence au nombre de gouttelettes à générer. La longueur d’onde fait référence à la longueur d’onde du DO à détecter. Réglez le nombre (maximum 200) et la longueur d’onde (350-800 nm) en fonction des exigences de l’expérience.
9. Lorsqu’une fenêtre contextuelle apparaît sur l’interface principale demandant « Retirez la bouteille de réactif entre C2 et O2, puis cliquez sur le bouton OK une fois terminé », ouvrez la porte de la chambre d’opération pour retirer la bouteille de réactif et connecter les connecteurs C2 et O2.
10. Fermez la porte et cliquez sur le bouton OK dans la fenêtre contextuelle pour cultiver automatiquement les gouttelettes et détecter les valeurs OD.
    NOTE: Le MMC détecte la valeur OD lorsque la gouttelette passe devant la sonde à fibre optique. Par conséquent, la période de détection dépend du nombre de gouttelettes générées.
11. Lorsque la courbe de croissance atteint la phase stationnaire, cliquez sur le bouton Exporter les données pour exporter les données OD. Sélectionnez le chemin d’enregistrement des données et exportez la valeur OD enregistrée pendant la période de culture au format .csv, qui peut être ouvert par un logiciel approprié (par exemple, Microsoft Excel). Utilisez ensuite un logiciel de cartographie (par exemple, EXCEL et Origin 9.0) pour tracer la courbe de croissance.
    NOTE: Pendant le processus de culture, il est possible de cliquer à tout moment sur l’exportation de données pour exporter les données OD de toutes les gouttelettes actuelles.

Résultats

Figure 1 : Structure et outils essentiels de la MMC. (A) Chambre externe et opérationnelle de la MMC. (B) La puce microfluidique de MMC. La puce dispose de sept canaux (C1-C6 et CF). (C) Flacon de réactif. Il a un tube supérieur et un tube latéral. Avant ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Membrane filtrante en PVDF de 0,22 μm	Merck Millipore Ltée	SLGPR33RB	Stériliser l’huile MMC
Réfrigérateur 4 °C	Haier	BCD-289BSW	Pour le stockage des réactifs
Agar-agar	Becton, Dickinson et compagnie	214010	Pour la préparation de plaques solides
Banc propre	Pékin Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	Pour le fonctionnement aseptique et la stérilisation UV
Ordinateur	Lenovo	E450	Installation du logiciel et contrôle MMC
Incubateur à température constante	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	Pour la culture microbienne en milieu solide
Balance électronique	OHAUS	AR 3130	Pour le pesage de réactifs
Tube EP	Thermo Fisher	1,5 mL	Pour la collecte des gouttelettes
Tube de congélation	Thermo Fisher	2,0 ml	Pour la conservation de la souche
Glycérol	GÉNÉRAL-RÉACTIF	G66258A	Pour la conservation de la souche
Pot de stérilisation à la vapeur à haute pression	SANYO Électrique	MLS3020	Pour la stérilisation autoclavée
Système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Effectuer la détermination de la courbe de croissance et l’évolution adaptative. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Puce microfluidique	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	Pour diverses opérations de gouttelettes. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
Huile MMC	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	La phase huileuse pour la microfluidique des gouttelettes. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
NaCl	GÉNÉRAL-RÉACTIF	G81793J	Composant du support LB
Pétri	Corning Incorporated	90 millimètre	Pour la préparation de milieu solide
Pipette	Eppendorf	2,5 μL, 10 μL, 100 μL, 1000 μL	Pour la manipulation de liquides
Connecteur rapide A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	Pour la connexion de chaque joint. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
Flacon de réactif	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Échantillonnage et stockage de la solution bactérienne et des réactifs. Veuillez vous référer à http://www.tmaxtree.com/en/
Fiole agitée	Union-Biotech	50 ml	Pour la culture microbienne
Incubateur à secousses	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	Pour la culture microbienne en gourde
Seringue	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 ml	Prélevez le liquide et injectez-le dans le flacon de réactif
Aiguille de seringue	Quincaillerie OUBEL	22G	Le diamètre intérieur est de 0,41 mm et le diamètre extérieur est de 0,71 mm.
Tryptone	Oxoid Ltée	Réf. LP0042	Composant du support LB
Réfrigérateur à très basse température	SANYO Ultra-faible	MDF-U4086S	Pour la conservation de la souche (-80 °C)
Spectrophotomètre UV-Vis	Compagnie General Electric	Ultrospec 3100 pro	Pour la mesure des valeurs de diamètre extérieur
Extrait de levure	Oxoid Ltée	LP0021 (en anglais)	Composant du support LB