Transformation naturelle et expression de la GFP chez la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacuna

Résumé

Source : Weber, N., et al., Transformation naturelle, expression protéique et cryoconservation de la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo décrit une procédure de transformation naturelle dans les cyanobactéries filamenteuses à l’aide de l’ADN plasmidique pour obtenir une expression stable de la GFP et une résistance aux antibiotiques par recombinaison homologue.

Protocole

1. Transformation naturelle et expression de la GFP

NOTE: La transformation est basée sur un vecteur plasmidique propagé chez Escherichia coli (E. coli) ; pGEM-T ou pUC19 peuvent être utilisés comme vecteurs de squelette. Des exemples de vecteurs pour l’expression de la protéine fluorescente verte superfolder (sfGFP) sont décrits dans la section des résultats représentatifs.

1. Effectuer toutes les étapes à l’aide de matériel stérile dans des conditions de laboratoire stériles (paillasse propre, verrerie stérile).
2. Inocuculer 2 x 50 mL de milieu liquide f/2 dans deux flacons de 250 mL avec 2 x 1 mL de filaments de Phormidium lacuna (P. lacuna) provenant d’une culture en cours. Cultiver à la lumière blanche (50 μmol ^{m-2 s-1}) sous agitation (rotation horizontale, 50 tr/min) pendant ~5 jours à 25 °C.
3. Préparez ~200 μg de l’ADN du vecteur de transformation à l’aide d’un kit de préparation midi selon les instructions du fabricant.
4. Homogénéiser 100 mL de suspension cellulaire de P. lacuna (voir le Tableau des matières) à 10 000 tr/min pendant 3 min. Mesurez le diamètre extérieur à 750 nm (valeur souhaitée = 0,35).
5. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 15 min à 6 000 × g. Retirer le surnageant et suspendre la pastille dans 800 μL (volume total comprenant le liquide résiduel et les filaments) du liquide restant et du milieu f/2⁺ supplémentaire.
6. Prélever huit plaques de bacto-gélose f/2⁺ (10 cm de diamètre) contenant 120 μg/mL de kanamycine. Pipeter 10 μg d’ADN au milieu de chaque plaque de gélose. Pipeter immédiatement 100 μL de suspension cellulaire au milieu de chaque plaque de gélose (au-dessus de l’ADN).
7. Gardez la plaque de gélose sans couvercle sur le banc propre pour permettre à l’excès de liquide de s’évaporer. Fermez la plaque et cultivez-la à la lumière blanche à 25 °C pendant 2 jours.
8. Répartir les filaments de chaque plaque de gélose à l’aide d’une boucle d’inoculation sur plusieurs plaques de bacto-gélose fraîches f/2⁺ contenant 120 μg/mL de kanamycine. Cultivez les plaques à une lumière blanche à 25 °C et vérifiez régulièrement les cultures au microscope.
9. Identifiez les filaments vivants et transformés après 7 à 28 jours au microscope. Recherchez des filaments sains et verts (figure 1) qui sont différents des autres filaments. Si ces filaments verts peuvent être identifiés, passez à l’étape suivante ; Sinon, conservez l’assiette encore 7 jours.
10. À l’aide d’une pince, transférez ces filaments vivants identifiés dans 50 mL de milieu liquide f/2⁺ avec 250 μg/mL de kanamycine. Cultiver en lumière blanche à 25 °C sur un agitateur (rotation horizontale, 50 tr/min). Observez la croissance jusqu’à quatre semaines.
11. Transférez les filaments dans un milieu gélosé contenant 250 μg/mL de kanamycine et attendez que les filaments se développent. Après plusieurs jours, transférer les filaments simples dans une plaque de gélose fraîche avec une concentration plus élevée de kanamycine, par exemple 500 μg/mL. Conservez la plaque d’origine.
12. S’assurer que les filaments sont multipliés à une forte concentration de kanamycine en culture liquide ou sur gélose. Augmentez à nouveau la concentration de kanamycine pour accélérer la ségrégation. NOTE: P. lacuna transformé se développe dans une quantité allant jusqu’à 10 000 μg/mL de kanamycine. D’autres espèces pourraient ne pas tolérer des concentrations aussi élevées.
13. Pour l’expression de la GFP : observer des filaments uniques avec un microscope à fluorescence à un grossissement de l’objectif réglé à 40x ou 63x. Capturez une image de transmission en fond clair et une image de fluorescence. Utilisez les paramètres suivants pour la GFP : bande passante 470 nm pour l’excitation, bande passante 525 nm pour l’émission et un séparateur de faisceau 495 nm, temps d’exposition initial de 500 ms.
14. Ajustez le temps d’exposition pour des signaux de fluorescence clairs, en évitant les intensités saturantes. Essayez d’utiliser le même paramètre pour tous les échantillons.
15. Comme les filaments de type sauvage présenteront également une fluorescence, capturez des images avec les mêmes paramètres que ci-dessus pour cette fluorescence de fond.REMARQUE : La souche exprimant la GFP doit avoir un signal plus élevé ; sinon, il n’exprime pas la GFP.
16. Sur la base des temps d’exposition et des intensités de pixels des images de fluorescence, calculez et comparez la teneur en GFP des différents filaments.

Résultats

Graphique 1. Filaments de Phormidium lacuna 5 semaines après la transformation. Le vecteur d’expression sfGFP pMH1 a été utilisé ; la sélection a eu lieu sur un milieu f/2 avec 120 μg/m...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bacto Agar	OttoNorwald	214010
Fluorescence microscope ApoTome	Zeiss
Microscope à fluorescence Axio Imager 2	Zeiss
Kanamycine	Sigma-Aldrich	25389-94-0
Microscope DM750	Zeiss
Kit d’extraction de plasmides de préparation Midi NucleoBond Xtra Kit Midi	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410,50
Source lumineuse, tube fluorescent L18W/954 lumière du jour	OSRAM		Culture de cyanobactéries
Source lumineuse, panneau LED XL 6500K 140 W	Étoile de floraison	N/A	Culture de cyanobactéries
Boîtes de Pétri polystyrène, 100 mm x 20 mm	Merck	Réf. P5606-400EA
Boîtes de Pétri polystyrole, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Pipetman 100-1 000 μL	Gilson	Réf. : FA10006M
Pipetman 10-100 μL	Gilson	Réf. : FA10004M
Pipettes en plastique 10 mL, stériles	Greiner	607107
Agitateur Unimax 2010	Heidolph Instruments		Pour la culture
Tube en plastique, stérile, 50 mL	Greiner	227261
Ultraturrax Silent Crusher M	Heidolph Instruments		Homogénéisateur
F/2+ fluide	f/2-moyen, avec une augmentation de 10 fois plus de NaNO₃ et de NaH₂PO₄ (0,88 mM NaNO₃, 36 μM NaH₂PO₄
Gélose F/2+	3 % (p/v) de gélose bacto, eau de mer artificielle, solution d’oligo-éléments à 0,1 % (v/v), solution vitaminique à 0,05 % (v/v), 8,8 mM de NaNO₃, 0,36 mM de NaH₂PO₄