Génération de pellicules bactériennes nanocellulosiques intégrées à la magnétite

Résumé

Source : Arias, S. L., et al. Fabrication d’une nanocellulose bactérienne magnétique fonctionnalisée avec des nanoparticules d’oxyde de fer. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre la synthèse in situ de nanoparticules de magnétite à l’intérieur d’une pellicule bactérienne de nanocellulose produite par Gluconacetobacter xylinus. Il explique comment la nanocellulose bactérienne magnétique est générée par infusion d’ions fer, précipitation alcaline et purification.

Protocole

1. Synthèse de nanoparticules d’oxyde de fer recouvertes de polymère et leur dépôt dans une membrane de nanocellulose bactérienne (BNC)

1. Faites buller 1 000 ml d’eau de haute pureté avec de l’azote afin d’éliminer tout oxygène dissous dans l’eau et remplacez-le par de l’azote.
2. Utilisez une fiole à fond rond à trois cols pour préparer une solution dans un ratio molaire de 2:1 de chlorure de fer (III) hexahydrate (FeCl_{3,6H 2}O) et de chlorure de fer (II) tétrahydrate (FeCl_{2,4H 2}O) dilué avec de l’eau désoxygénée de haute pureté. Par exemple, utilisez 5,4 g de FeCl_{3,6H 2}O et 1,98 g de FeCl_{2,4H 2}O dans 10 ml d’eau haute pureté désoxygénée. Si cette préparation devient trop visqueuse et difficile à remuer, utilisez 0,54 g de FeCl_{3,6H 2}O et 0,198 g de FeCl 2,4H₂O dans 20 ml d’eau haute pureté désoxygénée.
   NOTE: Réduisez le temps d’exposition du FeCl_{2,4H 2}O à l’air en pesant ce composé chimique aussi rapidement que possible. Une fois introduit dans la fiole à fond rond à trois cols, fermez la fiole à trois cols à fond rond avec des bouchons de septum jusqu’à ce qu’elle soit connectée à l’alimentation en gaz azote et au tube du condenseur.
3. Utilisez deux cous du récipient pour assurer une entrée et une sortie constantes d’azote en reliant l’alimentation en gaz azote à une aiguille percée dans un bouchon de cloison et fixée aux cous du récipient.
4. Placez 1 pellicule BNC (15,6 mm de diamètre et 2-3 mm d’épaisseur) dans le récipient avec les réactifs. Assurez-vous que l’échantillon est complètement immergé dans le liquide.
5. Reliez le col restant du récipient à un tube de condensation. De plus, utilisez un tube de séchage rempli de sulfate de calcium anhydre sur le dessus du tube du condenseur. Fais passer de l’eau par le tube du condenseur.
6. Scellez tous les joints en verre avec de la graisse sous vide.
7. Chauffez la solution dans un bain d’huile en silicone à 80 °C à l’aide d’une plaque chauffante et maintenez cette température jusqu’à l’étape 1,10. Utilisez une petite barre magnétique pour mélanger les réactifs à 350 tr/min pendant 5 minutes. Assurez-vous que le BNC est correctement imprégné de la solution ferreuse et que les réactifs sont complètement dissous. Continuez à remuer le mélange jusqu’à la fin de l’expérience.
   NOTE: Utilisez un thermomètre pour vérifier la température de l’huile de silicone. Il devrait rester stable à 80 °C.
8. Augmentez la vitesse de brassage à 700 tr/min et ajoutez (en descendant), dans un intervalle de 5 minutes, 5 ml d’hydroxyde d’ammonium (NH₄OH, 14 %) aux 10 ml de solution ferreuse à l’aide d’une aiguille à pipetteter, qui a également été perforée dans un bouchon de cloison nasale. Après l’ajout de l’hydroxyde d’ammonium, la couleur de la solution passe du jaune/orange au noir.
9. Continuez à remuer la solution à 80 °C pendant encore 5 minutes. Évitez les brassages à grande vitesse afin de préserver l’intégrité de l’échantillon. Les vitesses élevées, c’est-à-dire supérieures à 1 000 tr/min, peuvent détruire l’échantillon.
10. Baissez la température de la solution à 30 °C en utilisant le dessous de contrôle de température de la plaque chauffante et continuez à remuer encore 5 minutes. Ensuite, éteins la plaque chauffante. À ce stade, les nanoparticules d’oxyde de fer (IONP) ont été intégrées au maillage BNC.
11. Refroidissez le mélange à température ambiante (RT) et séparez les nanoparticules magnétiques (MNP) et le BNC à l’aide d’un aimant permanent puissant (par exemple, 1 Tesla). Pour cela, transférez le mélange dans une fiole de récipient puis, tout en gardant l’aimant près du récipient, maintenez les MNP et le BNC en place tout en décantant le surnageant.
    Note: Faites attention lorsque vous manipulez des aimants puissants car ils peuvent être dangereux s’ils sont mal utilisés. Pour les étapes (1.12) - (1.14) et (1.16), utilisez l’eau de haute pureté désoxygénée préparée précédemment dans (1.1) pour empêcher l’oxydation des particules.
12. Resuspendez les MNP et le BNC dans 100 ml d’eau. Secouez doucement la solution pour éliminer tous les MNP qui ne sont pas fortement intégrés au BNC. Dégradez à nouveau le surnageant en maintenant les MNP et le BNC en place à l’aide de l’aimant.
13. Lavez les MNP et le BNC plusieurs fois avec de l’eau jusqu’à ce que le surnageant atteigne un pH neutre (pH~7), mesuré à l’aide d’une bande colorimétrique.
14. Séparez le BNC fonctionnalisé magnétiquement ou nanocellulose bactérienne magnétique (MBNC) des MNP à l’aide d’une pince à épiler et rincez le MBNC plusieurs fois à l’eau jusqu’à ce que l’eau soit claire.
15. Stérilisez le MBNC en exposant le MBNC O/N aux UV (110-280 nm).
16. Autoclave 500 ml d’eau haute pureté désoxygénée à 120 °C pendant 20 minutes et stockez le MBNC dans 20 ml de cette eau.
17. De façon aseptique, immergez l’échantillon dans 1 % de polyéthylène glycol (PEG) et remuez pendant 2 heures à la température réactive (37 °C). Cette procédure améliore la biocompatibilité et la stabilité des nanoparticules d’oxyde de fer déposées dans le BNC, en particulier celles exposées à la surface. Le revêtement PEG sera distribué sur le réseau 3D MBNC.
    NOTE: Les IONP nus s’oxydent facilement dans l’air en raison de leur forte activité chimique. Bien que le PEG soit considéré comme un matériau non biodégradable, sa stabilité chimique dépend des conditions biologiques appliquées telles que la teneur en eau, le pH, la température, la présence d’enzymes, les espèces réactives d’oxygène, les espèces réactives d’azote, et d’autres.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Chlorure de fer(III) hexahydrate	Sigma Aldrich	236489-100G
Hydroxyde d’ammonium	Macron Fine Chemicals	6665-46
Poly (éthylène glycol), moyenne Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Chlorure de fer (II) tétrahydrate	Sigma Aldrich	44939-250G
Sulfate de calcium anhydre	W.A. Hammond Drierite	13001
Graisse à haute teneur sous vide	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Bandes testeuses de pH	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Flasque distillatrice à trois angles de col à fond rond	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Huile de silicone pour bains d’huile	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Tube de séchage	Chemglass	CG-1295-01
Bouchon de septum, type de manchon	Chemglass	CG-3022-98
Barre-agitateur magnétique	Chemglass	CG-2001-05
Condenseur	Chemglass	CG-1218-01
Contrôleur de température	BriskHeat	SDC120JC-A
Plaque chauffante de brassage	Fisher Scientific	11-100-49SH