Essai fluorescent à haut débit pour étudier les interactions microbe-ver

Résumé

Source : Ali, I., et al. Dépistage à haut débit des isolats microbiens ayant un impact sur la santé de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo présente un test fluorescent à haut débit pour évaluer comment les bactéries intestinales affectent la résilience au stress chez Caenorhabditis elegans. En suivant la fluorescence bleue des granules intestinaux rompus, le test révèle des signaux de mort plus précoces chez les vers exposés aux bactéries testées.

Protocole

1. Système sans étiquetage de Caenorhabditis elegans (C. elegans), score de survie (LFASS) et installation de tests oxydatifs (Jours 13 - 14)

1. Évaluez le stade de développement des vers. Une fois que >90 % des vers ont atteint L4, prélever les vers dans jusqu’à 10 mL de solution stérile de M9 dans des tubes coniques de 15 mL.
2. Lavez les vers en profondeur (au moins 4 fois) en les filant à 142xg pendant 2 minutes à 4 °C, en retirant le surnageant, et en ajoutant 10 mL de M9 stérile frais entre chaque lavage pour éliminer la bactérie Escherichia coli OP50. Résuspendez la pastille de vers dans 10 mL de M9.
3. Transférez 50 μL de solution de vis sans fin dans un tube de liaison à faible surface contenant 950 μL de M9. Après avoir délicatement mélangé le contenu du tube pour éviter la sédimentation par les vers, utilisez rapidement une pointe de pipette humidifiée à faible liaison pour transférer 3 à 4 gouttes séparées de 10 μL sur une lame en verre ou une plaque de milieu de croissance nématode (NGM). Comptez les nombres de vers sous un stéréomicroscope à un gros grossissement de 16x. Faites la moyenne des comptes des 3 à 4 gouttes et déterminez le nombre de vers par microlitre dans la solution de vers.
4. Ajustez la concentration de vers dans le tube de 10 mL pour atteindre ~120 vers en 8 μL. Si la solution a été préparée à l’étape 1.2. ne sont pas assez concentrés, faire tourner les vers vers le bas et retirer M9 en conséquence pour atteindre 120 vers par 8 μL.
5. Transférez 8 μL de solution de vers (~120 vers) dans chacun des puits des huit plaques NGM-agarose à 96 puits préparées précédemment, à l’aide d’une pipette multicanal ou d’une pipette à répétition. Veillez à utiliser des embouts à faible rétention pour limiter la perte de vers. Il peut également être nécessaire de couper les extrémités des extrémités pour permettre à de gros vers adultes de limiter la contrainte mécanique sur les vers adultes.
   NOTE: Le test nécessite au minimum 30 vers vivants et sains pour fonctionner de manière fiable, mais fonctionne mieux avec environ 100 vers par puits.
6. Incubez les plaques NGM-agarose à 96 puits semées par le ver et la bactérie à 25 °C pendant 36 heures.
7. Vérifiez les plaques entre 12 et 24 heures, en veillant à ce que les vers restent bien remplis tout au long du processus. Si une réalimentation est nécessaire, resuspendez les bactéries dans la plaque du réseau bactérien à 96 puits stockée à 15 °C, et ajoutez jusqu’à 10 μL de la solution bactérienne correspondante aux plaques NGM-agarose à 96 puits où les vers risquent de mourir de famine avant la fin de la période d’incubation de 36 heures (les vers affamés produiront des résultats très différents, C’est donc très important).
   NOTE: Les étapes suivantes doivent être menées au jour 15. Avant de commencer le test, il peut être nécessaire d’optimiser la hauteur de lecture. La lecture optimale sera obtenue à 20-50 μm au-dessus du fond du puits. Cela dépendra du modèle du lecteur de plaques. Certains offrent la possibilité d’un Z-scan, tandis que d’autres permettent une saisie manuelle de la hauteur. Régler la hauteur optimale au niveau où le signal de fluorescence bleue le plus élevé (365 nm/430 nm) est détecté. Certains lecteurs de plaques peuvent fonctionner à une hauteur fixe, optimisée pour les tests à cellules adhérentes, et ne sont pas forcément idéaux pour les tests LFASS.
8. Après 36 heures, distribuez 30 μL de M9 dans chaque puits de la plaque à 96 puits.
   NOTE: Pour les tests de contrainte thermique, le lecteur de plaques doit avoir atteint la température requise pour effectuer le test et peut devoir être allumé à l’avance. Le protocole actuel utilise 42 °C pour maximiser la vitesse d’élimination, mais cette approche s’applique à d’autres températures supérieures à 30 °C.
9. Transférez les vers (environ 20 μL) sur la plaque de 384 puits selon les dispositifs de l’ensemble, en utilisant des pointes à faible rétention (envisagez de couper l’extrémité des extrémités pour permettre aux gros vers de réduire la contrainte mécanique des vers adultes).
   NOTE: Pour la présente étude, deux réglages différents de lecteur de plaques sont utilisés pour les deux tests décrits ici (contrainte thermique et contrainte oxydative), et ainsi, les échantillons destinés à ces deux tests ne doivent pas être placés sur la même plaque à 384 puits.
10. Assurez-vous que les lecteurs de plaques sont bien installés (Tableau 1).
11. Complétez les plaques de 384 puits avec plus de M9, visant un volume final de 60 μL par puits. Pour le test de contrainte thermique, ajouter 40 μL de M9, et pour le stress oxydatif induit par l’hydroperoxyde de tert-butyl (t-BHP), ajouter 34 μL de M9 dans 6 μL de t-BHP.
    1. Commencez le test dans les 2 minutes suivant l’ajout de t-BHP (idéalement, tous les vers doivent être exposés simultanément à t-BHP, la résolution du temps d’essai étant de 2 min). Si ce n’est pas possible, utilisez un minuteur pour estimer le temps passé à pipetter t-BHP avant le début du test afin de permettre un ajustement ultérieur du temps médian de décès.
12. Fermez les assiettes avec leur couvercle transparent. Scellez les bords des plaques à 384 puits avec du ruban adhésif (en tapant sur la plaque et le couvercle), en veillant à ce que le ruban ne passe pas par-dessus le couvercle ou sous la plaque. Fendez le ruban entre le couvercle et la plaque à intervalles réguliers à l’aide d’un scalpel pour permettre l’échange d’air tout en minimisant l’évaporation lors du test.
13. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques et commencez la sortie. Visez à exciter à 365 nm et à détecter l’émission à 435 nm toutes les 2 minutes pendant 6 à 12 heures (Tableau 1).
    NOTE: En général, 6 h suffisent pour des tests de stress thermique à 42 °C et 8 h pour des tests de stress oxydatif à 7 % t-BHP.

Tableau 1 : Paramètres des tests oxydatifs et de contraintes thermiques. Exemples de réglages utilisés pour les tests de contrainte oxydative (A) et thermique (B) sur les lecteurs de plaques de fluorescence utilisés dans cette étude.

Matériaux