Extraction des bactéries apoplasiques à l’aide d’une méthode de pression à base de seringue

Résumé

Source : Rufián, J. S., et al, Analyse unicellulaire de l’expression des gènes de Pseudomonas syringae dans le tissu végétal. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre une méthode de pression basée sur une seringue pour extraire les bactéries apoplasiques, qui prolifèrent et forment des microcolonies au sein de l’apoplaste, l’espace intercellulaire entre les cellules végétales. La méthode permet d’obtenir des échantillons bactériens sans débris, adaptés à l’analyse monocellulaire en aval.

Protocole

Extraction de bactéries de l’apoplaste

1. Quatre jours après l’inoculation, coupez soit la partie aérienne de la plante d’Arabidopsis , soit la feuille inoculée de la plante de haricots et placez-la dans une seringue de 20 mL sans aiguille (Figure 2G). Pour les feuilles de haricot, roulez la feuille sur elle-même, en laissant la face abaxiale vers l’extérieur, comme montré à la Figure 2F.
2. Ajoutez suffisamment d’eau distillée pour recouvrir le tissu (généralement 10 à 15 mL).
3. Insérez le piston, et avec la seringue en position verticale, la pointe vers le haut, retirez l’excès d’air et de bulles d’air à l’intérieur de la seringue en tapotant doucement le canon jusqu’à ce que tout l’air soit près de la pointe. Faites glisser le plunger pour retirer l’air. Une fois qu’il y a le moins d’air possible à l’intérieur de la seringue, couvrez la pointe du canon de la seringue avec un film de paraffine.
4. Appuyez soigneusement sur le piston pour générer une pression positive jusqu’à ce que le tissu devienne plus foncé (Figure 1I et Figure 2H). Ensuite, tirez sur le piston pour générer une pression négative (Figure 1J et Figure 2I). Répétez cette étape 3 à 5 fois.
5. Retirez le film de paraffine et le piston et collectez le liquide contenant les bactéries extraites de l’apoplaste, comme dans la figure 2J.

Résultats

Figure 1 : Inoculation bactérienne et extraction d’apoplastes à l’aide de plantes d’Arabidopsis. (A) Préparation du pot avec la grille métallique correctement fixée. (B)

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 20 mL			Aucune exigence particulière
Tubes coniques de 50 mL	Sarstedt
Parafilm	Emballage plastique Pechiney
Brucelles			Aucune exigence particulière
Chambre à vide de 25 cm de diamètre	Kartell	554
Pompe à vide	GAST	DOA-P504-BN