Expression inductible de la chaîne A de la toxine ricine marquée à l’histidine dans E. coli

Résumé

Source : Becker, B., et al. Un simple test de reporter basé sur la fluorescence pour identifier les composants cellulaires nécessaires au trafic de la chaîne de la toxine A (RTA) dans la levure. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo démontre l’expression inductible de la chaîne de la toxine ricine A (RTA) marquée à His, dans Escherichia coli. Il décrit les étapes impliquées dans la culture sélective des bactéries transformées avec un plasmide d’expression recombinante, l’induction de l’expression RTA marquée par His, et la préparation des bactéries pour une analyse ultérieure.

Protocole

1. Expression hétérologue de la chaîne de toxine ricine A (RTA) marquée à His dans Escherichia coli

1. Transformez les cellules d’Escherichia coli (E. coli) avec le plasmide d’expression pET24-RTA_(His)6 ou le vecteur vide pET24a⁽⁺⁾ en utilisant des protocoles d’électroporation standard. Les cellules contenant le plasmide vide servent de témoin négatif.
2. Après sélection des clones positifs sur des plaques LB contenant de la kanamycine (100 μg/mL) LB (bouillon de lysogenèse), inoculez les cellules contenant le plasmide d’expression RTA ou le vecteur vide dans un milieu_kan de 5 mL LB (milieu LB avec 100 μg/mL de kanamycine) et incubez à 37 °C et 220 tr/min pendant 24 heures.
3. Compléter 1 L LB_{de kan} medium avec 5 mL de pré-culture et incuber les cellules à 37 °C et 220 tr/min jusqu’à ce que les cellules atteignent un OD_{de 600} de 0,8-1,0 (environ 3-4 heures). Ensuite, réduisez la température de culture à 28 °C et préparez une solution de stock isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dans H_2O.
4. Induire l’expression RTA de l’E. coli en ajoutant l’IPTG à une concentration finale de 1 mM.
5. Après 3,5 h à 28 °C et 220 tr/min, prélever les cellules par centrifugation à 10 000 x g et 4 °C pendant 10 minutes, laver le pellet deux fois avec 5 mL de tampon de liaison (500 mM NaCl, 10 mM imidazole et 20 mM_{KH 2}PO₄, pH = 7,4) à 10 000 x g et 4 °C pendant 10 minutes, et resuspendre le pellet dans un tampon de liaison de 5 mL.
   NOTE: Le protocole peut être mis en pause à ce stade, et les cellules peuvent être stockées à 80 °C pendant plusieurs jours.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souche bactérienne
E. coli BL21 DE3 (Or)	Agilent Technologies	230130
Plasmides utilisés dans ce protocole
pET24a⁽⁺⁾ (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA₍His₆₎
Réactifs
Médium à bouillon LB	Thermo Scientific	10855021	15 g d’agar ont été ajoutés pour la production de plaques
Agar-agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G