Une technique de chromatographie d’affinité pour la purification d’une protéine bactérienne recombinante

Résumé

Source : Becker, B., et al. Un simple test de reporter basé sur la fluorescence pour identifier les composants cellulaires nécessaires au trafic de la chaîne de la toxine A (RTA) dans la levure. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo démontre la purification d’une protéine recombinante marquée à la polyhistidine en utilisant la chromatographie d’affinité à base de nickel. Il décrit les étapes clés, notamment la lyse bactérienne par sonication, la clarification et la filtration du lysat, ainsi que la liaison sélective et l’élution de la protéine cible à l’aide de l’imidazole.

Protocole

1. Purification de l’ATR marqué à His via chromatographie d’affinité

1. Soniser les cellules sur la glace en suivant le protocole suivant : impulsion de 15 s (20 microns), pause de 30 s. Répétez cette étape cinq fois.
2. Lysat de cellule centrifugeuse à 21 000 x g et 4 °C pendant 15 minutes et filtre le surnageant à l’aide d’un système de filtration à seringue stérile (pore de 0,2 μm).
   NOTE: Les granulés cellulaires d’échantillons sonés avec succès présentent des bordures transparentes.
3. Utilisez un système de purification automatisé équipé d’une colonne d’affinité de 5 mL à base de^{Ni 2+} pour purifier la fraction RTA marquée par Him à partir du surnageant E. coli filtré stérile . En général, utilisez une vitesse d’élution de 1 mL/min et refroidissez tout le système de purification pour éviter une liaison inefficace des toxines et la perte d’activité toxique.
   NOTE: Les paramètres d’une purification efficace des RTA sont listés dans le tableau 1.
   1. En résumé, équilibrez la colonne d’affinité avec 20 mL de tampon de liaison pour retirer le tampon de stockage. Appliquez du surnageant filtré stérile sur la colonne d’affinité à l’aide d’une seringue.
   2. Lavez la colonne avec 25 à 35 mL de tampon de liaison pour éliminer les protéines non liées de la colonne. Effectuez l’étape de lavage jusqu’à ce que l’absorption UV à 280 nm soit proche de la valeur UV initiale.
   3. Fraction RTA liée à l’élution dans 20-35 mL de tampon d’élution (500 mM imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM_{KH 2}PO₄, pH = 7,2) et garder l’échantillon sur glace (Figure 1A et Figure 1B).
      NOTE: L’élution de la fraction RTA est caractérisée par une augmentation de l’absorption UV. Veuillez noter qu’il faut collecter exclusivement cette fraction afin d’éviter la contamination par des protéines liées non spécifiques.

Tableau 1 : Paramètres utilisés pour la purification d’affinité et le désalage par colonnes. Liste de tous les réglages de colonnes pertinents (par exemple, débit, concentration du tampon d’élution, équilibre et durée de l’étape de lavage) et paramètres mesurés (par exemple, conductance ou absorption UV).

Paramètre de chromatographie d’affinité
Paramètres de mesure	UV (280 nm), concentration du tampon d’élution, conductance
Paramètres	Variable/Unité	Valeur
Débit	mL/min	1
Pression maximale de colonne	Mpa	0.35
Longueur d’onde	Nm	280 nm
Tampon de liaison	Position de la pompe	Un
Tampon d’élution	Position de la pompe	B
Tampon d’élution de concentration de démarrage	%	0
Compensation de volume système	Ml	10
Équilibrage des colonnes	Ml	20
Injection d’échantillon via superloop/seringue	Ml	Volume du lysat cellulaire
Étape de lavage	Ml	20-35
Étape d’élution	Ml	20-35
Tampon d’élution de concentration pendant l’élution	%	100
Recalibrage de la colonne avec 20 % d’EtOH	Ml	50
Paramètre de dessalage
Paramètres de mesure	UV (280 nm), Conductance
Paramètres	Variable/Unité	Valeur
Débit	mL/min	4
Pression maximale de colonne	Mpa	0.35
Longueur d’onde	Nm	280 nm
Tampon de liaison	Position de la pompe	Un
Tampon d’élution	Position de la pompe	B
Tampon d’élution de concentration de démarrage	%	0
Compensation de volume système	Ml	10
Équilibrage des colonnes	Ml	20
Injection d’échantillon via superloop/seringue	Ml	Volume du lysat cellulaire
Injection tampon de désalation (sorbitol 0,8 M)	Ml	100
Recalibrage de la colonne avec 20 % d’EtOH	Ml	50

Résultats

Figure 1 : Résultats représentatifs de chromatographie d’affinité et de désalage des cellules d’E. coli contenant pET-RTA_(His)6 ou le contrôle vectoriel vide. (A) Graphique de purificati...

Matériaux