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1. Préparation de la nanocellulose bactérienne (BNC)
Note: Toutes les étapes sont effectuées dans des conditions aseptiques, sauf indication contraire.
- Préparez le médium de culture.
- Préparez 500 ml de milieu de culture liquide en combinant 25 g d’extrait de levure, 15 g de peptone, 125,0 g de mannitol et 500 ml d’eau de haute pureté. Autoclave ce mélange à 120 °C pendant 20 minutes et conserve à 4 °C.
- Préparez 100 ml de milieu semi-solide en ajoutant 15 g d’agar à 5,0 g d’extrait de levure, 3,0 g de peptone, 25,0 g de mannitol et 100 ml d’eau à haute pureté. Autoclavez ce mélange à 120 °C pendant 20 minutes. Une fois autoclave, déposez 5 ml du mélange dans une boîte de Petri en plastique de 90 mm x 16 mm. Laissez la solution gélifier à 4 °C et conservez à cette température jusqu’à une utilisation ultérieure.
- Souche de Glucoacetobacter xylinus (G. xylinus ) réhydrate conservée dans des fioles lyophilisées en ajoutant 1 ml de milieu de culture liquide et en pipettant de haut en bas, comme indiqué par les instructions du fabricant.
- Inoculez les boîtes de Petri contenant un milieu semi-solide avec de petites gouttelettes de suspension bactérienne à l’aide d’une boucle inoculante. Assurez-vous que l’inoculum couvre toute la boîte de Petri en déplaçant la boucle en zigzag du bord au centre de la plaque.
- Incubez les boîtes de Petri à 26 °C pendant 72 heures dans un incubateur sans CO2. Une fois la période d’incubation terminée, de petites colonies blanches sont visibles. Si les colonies ne sont pas utilisées immédiatement, conservez les boîtes de Petri à 4 °C en scellant le couvercle avec du Parafilm et en plaçant les plats à l’envers. Les colonies peuvent être conservées ainsi jusqu’à 6 mois.
- Transférez 2 ml du milieu de culture liquide dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Prenez deux colonies avec une aiguille inoculante provenant des boîtes de Petri inoculées et placez-les dans le premier puits de la plaque de culture tissulaire. Répétez la même procédure pour les 23 puits restants.
- Incubez la plaque de culture tissulaire à 30 °C pendant 7 jours. Cela donnera un total de 24 pellicules BNC d’un diamètre de 16 mm et d’une épaisseur d’environ 2 à 3 mm de diamètre, comme illustré à la Figure 1. Note: Ne dérangez la culture bactérienne à aucun moment pendant la période d’incubation, par exemple en secouant les plaques. Pendant la période d’incubation, G. xylinus extrudit des molécules de sucre de glucopyranose pour former un maillage cristallin polymérique à l’interface air-liquide, qui adopte la forme et la taille de la fiole en conditions de culture statiques. Cette matrice polymérique, appelée nanocellulose bactérienne (BNC), est visible à la fin de la période d’incubation.
- Prélever les pellicules BNC du milieu de croissance et les stériliser dans 200 ml de solution de NaOH à 1 % pendant 1 heure à 50 °C, afin d’éliminer toute trace de G. xylinus. En option, remuez cette solution à 300 tr/min à l’aide d’une barre magnétique et d’une plaque de brassage. Jetez la solution de NaOH et ajoutez 200 ml de solution de NaOH fraîchement préparée à 1 %. Répétez le même processus une fois de plus ou jusqu’à ce que les pellicules BNC en solution prennent une apparence translucide.
- Rincez les pellicules BNC à l’eau trois fois et conservez-les dans de l’eau haute pureté à RT. Assurez-vous que les pellicules BNC sont complètement immergées dans l’eau et ne sont pas laissées sécher à aucun moment.
- Autoclave les pellicules BNC à 121 °C pendant 20 minutes. Note : Une étude sous-cutanée in vivo sur le rat réalisée par Märtson et ses collègues n’a montré aucun signe de dégradation du BNC après 60 semaines d’implantation. En effet, le BNC est dégradable dans la nature par les enzymes microbiennes et fongiques, absentes chez les mammifères. En revanche, la biodégradabilité du BNC peut résulter de processus mécaniques, chimiques et biologiques qui affaiblissent le réseau microfibrillal in vivo.
