Isolement des endospores à partir d’un échantillon environnemental par lyse ciblée de cellules végétatives

Résumé

Source : Wunderlin, T., et al. Isolement physique des endospores à partir d’échantillons environnementaux par lyse ciblée des cellules végétatives. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre une méthode pour isoler des endospores à partir d’un échantillon environnemental contenant à la fois des cellules végétatives et diverses bactéries. La procédure implique la filtration, la perturbation mécanique et un traitement chimique sélectif pour affaiblir et lyser les cellules végétatives tout en préservant les endospores. La dernière étape isole les endospores résilientes par filtration membranaire.

Protocole

1. Préparation des produits chimiques et des équipements

1. Produire 500 ml d’une solution d’hexamétaphosphate de sodium (SHMP) (NaPO₃)_n à 1 % et stériliser par autoclavage.

2. Stériliser les filtres à nitrocellulose (NC) (pore 0,22 μm, diamètre 47 mm) en autoclavant dans des boîtes de Petri en verre fermées.

3. Stériliser les filtres NC (taille des pores 0,22 μm, diamètre 25 mm) en autoclavant dans des boîtes de Petri en verre fermées.

4. Peser et noter le poids à vide des tubes stériles de 50 ml (avec bouchon) (un tube par échantillon).

5. Préparer le tampon Tris-EDTA (TAMPON TE) 1x : réaliser une solution de 10 mM de Tris (tris(hydroxyméthyl)aminométhane) et 1 mM de tampon EDTA. Ajustez le pH à 8 et stérilisez par autoclav.

6. Préparer la solution lysozymique (20 mg/ml) en dissolvant 0,02 g de lysozyme dans 1 ml de tampon TE. Idéalement, il faut le rendre frais à chaque fois. Conserver à 4 °C pendant au maximum 1 semaine.

7. Préparer une solution physiologique en dissolvant 8 g/L de chlorure de sodium (NaCl) dans de l’eau distillée. Stérilisez par autoclav.

2. Séparation de la biomasse des sédiments

1. Ajouter 3 g d’échantillon de sédiments dans des tubes stériles prépesés de 50 ml à l’aide de cuillères métalliques à flamme d’éthanol. Effectuez cela dans un cabinet de biosécurité propre et stérilisé aux UV pour éviter toute contamination.

2. Ajouter 15 ml d’une solution SHMP stérile à 1 % (autoclave) à l’échantillon à l’aide d’une burette graduée stérile. La solution SHMP peut également être filtrée pour éviter toute contamination.

3. Homogénéiser le sédiment et la solution de SHMP avec un disperseur/homogénéiseur liquide (par exemple, homogénéiseur Ultra-Turrax). Stériliser ou autoclave à 70 % le rotor de dispersion avant utilisation. Faites fonctionner l’homogénéisation pendant 1 minute à 17 500 tr/min. Laissez l’échantillon reposer 2 minutes et répétez l’homogénéisation pendant 1 minute à la même vitesse du rotor.

4. Laisser l’échantillon reposer 10 minutes. À cette étape, les particules les plus lourdes (minéraux) se déposent. Les cellules et tous les composants organiques de l’échantillon, cependant, resteront en solution. Ensuite, transférez la solution surnageante (contenant la biomasse cellulaire) dans un tube propre de 50 ml, tout en prenant soin de ne pas déranger la granule de sédiments.

5. À la granule de sédiments, ajoutez à nouveau 15 ml d’une solution SHMP stérile à 1 % (autoclave) à l’aide d’une burette graduée stérile. Puis répétez les étapes 2.3 et 2.4. Cette répétition assure la séparation maximale de cellules et de particules organiques de la composante minérale du sédiment. Le surnageant de cette seconde séparation peut être fusionné avec le surnageant de la première séparation.

Note: Les étapes suivantes sont toutes effectuées sur le surnageant (contenant la biomasse cellulaire). Le composant minéral (pellets de sédiments) peut être jeté.

6. Centrifugez l’échantillon à 20 x g pendant 1 minute. Cette étape augmente suffisamment la force g pour déposer de petites particules minérales tandis que le matériel cellulaire biologique reste en solution. Après centrifugation, transférez la solution surnageante (contenant la biomasse cellulaire) dans un tube propre de 50 ml. Jetez la granule minérale.

7. Déterminer le volume final de la solution contenant de la biomasse en pesant l’échantillon. La détermination du poids évite de transférer l’échantillon dans un cylindre gradué et réduit le risque de contamination.

3. Collecte de biomasse sur membrane filtrante

1. Préparer une unité de filtration (pour membranes de 47 mm de diamètre) et une pompe à vide. Stérilisez l’unité de filtration soit par autoclavage, soit (si c’est du verre Pyrex) en la pulvérisant avec 70 % d’éthanol et en la brûlant avec un brûleur Bunsen. Laissez refroidir avant de poursuivre le protocole.

2. Ajouter une membrane NC stérile à l’unité de filtration à l’aide de pinces stérilisées à l’éthanol.

3. Ajouter la moitié de l’échantillon surnageant (de l’étape 2.6) sur l’unité de filtration à membrane et collecter les cellules de la membrane à l’aide de la pompe à vide.

4. Lorsque le liquide a complètement traversé le filtre, arrêtez la pompe à vide et retirez soigneusement la membrane à l’aide de pinces stérilisées à l’éthanol et à la flamme. Placez la membrane dans une boîte de Petri stérile.

1. Coupez la membrane en deux à l’aide de ciseaux stérilisés à l’éthanol. Ajoutez chaque moitié de la membrane dans un tube séparé de 2 ml. La moitié de la membrane sera utilisée pour l’extraction d’ADN et l’analyse de l’ensemble de la communauté bactérienne. L’autre moitié du filtre sera stockée à -80 °C et servira de secours.

5. Placer une nouvelle membrane NC sur l’unité de filtration et collecter la biomasse de la seconde moitié du volume d’échantillon (de l’étape 2.6) à l’aide de la pompe à vide.

6. Lorsque le liquide est complètement passé à travers le filtre, arrêtez la pompe à vide et retirez soigneusement la membrane à l’aide de pinces stérilisées à l’éthanol. Placez toute la membrane dans un tube séparé de 2 ml. Cet échantillon sera utilisé pour le traitement de séparation des endospores des cellules végétatives. L’échantillon peut être stocké à -20 °C jusqu’à utilisation.

4. Lyse des cellules végétatives

1. Effectuer le traitement pour séparer les endospores des cellules végétatives sur la biomasse précédemment collectée sur une membrane NC (étape 3.6).

1. Si la membrane était gelée, laissez-la en RT pendant 10 minutes pour qu’elle dégèle. Ensuite, placez la membrane dans une boîte de Petri stérile et coupez-la (environ 4 fois) en plus petits morceaux à l’aide de ciseaux stérilisés à flamme d’éthanol. Ensuite, placez toutes les pièces de filtre à membrane dans un tube stérile de 2 ml.

2. Ajouter 900 μl de tampon 1x TE (Tris-EDTA) (voir 1,5) au tube contenant la membrane de l’échantillon et mélanger soigneusement par vortex. À cette étape, la biomasse est retirée de la membrane dans la solution tampon TE.

3. Placez le tube dans un incubateur à 65 °C pendant 10 minutes et 80 tr/min. Ensuite, retirez le tube de l’incubateur et laissez-le refroidir pendant 15 minutes.

4. Ajouter 100 μl de lysozyme fraîchement préparée (voir 1,5) pour atteindre une concentration finale de 2 mg/ml. N’ajoutez pas la lysozyme avant que l’échantillon ne soit refroidi à 37 °C, car cela pourrait dégrader l’enzyme.

5. Incuber l’échantillon à 37 °C pendant 60 minutes et 80 tr/min, les conditions optimales pour que la lyse des cellules végétatives par la lyse.

6. Après la lyse, ajoutez 250 μl d’hydroxyde de sodium à 3 N (NaOH) et 250 μl de solution de dodécyle sulfate de sodium (SDS) à 6 % à l’échantillon. En ajoutant cela, le volume d’échantillon atteint 1,5 ml, avec une concentration finale de 0,5 N NaOH et une concentration finale de 1 % de SDS.

7. Incubez ce mélange à RT pendant 60 minutes et 80 tr/min. Ajouter la base et les détergents aidera à la lyse cellulaire finale. La concentration de ces détergents a été optimisée pour ne pas endommager les endospores lors de la lyse des cellules végétatives.

8. Préparez une unité de filtration stérile qui maintient des membranes de 25 mm de diamètre par autoclavage, ou (en cas de verre Pyrex) en la pulvérisant avec 70 % d’éthanol et en la brûlant avec un brûleur Bunsen. Laisse refroidir.

9. Placez une membrane NC de 0,2 μm (diamètre de 25 mm) sur l’unité de filtration à l’aide de pinces stérilisées à l’éthanol et à la flamme.

10. Ajouter l’échantillon de l’étape 4.7 sur la membrane et filtrer le liquide à l’aide de la pompe à vide. Lorsque le liquide est passé, coupez la pompe à vide. À cette étape, le matériau cellulaire végétatif lysé est retiré, car il n’est pas retenu sur la membrane. Seules les endospores resteront sur la membrane.

11. Ajouter 2 ml de solution physiologique stérile pour éliminer les détergents résiduels et filtrer le liquide à l’aide de la pompe à vide.

12. Lorsque le liquide est complètement filtré, éteignez la pompe à vide. Laissez la membrane sur l’unité de filtration.

Matériaux