Générer des cultures bactériennes pures dans un milieu liquide

Résumé

Source : Brumfield, K. D. et al., Techniques de laboratoire utilisées pour maintenir et différencier les biotypes des isolats cliniques et environnementaux de Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre la croissance des cultures bactériennes dans un milieu liquide. Le secouement favorise l’aération et répartit les nutriments de manière uniforme, favorisant une croissance exponentielle et aboutissant à une suspension uniforme et métaboliquement active, adaptée aux applications en aval.

Protocole

1. Entretien et croissance des souches de Vibrio cholerae

1. Préparation et utilisation des cultures de stock congelées
   1. Pellet 1,8 mL de culture liquide pendant la nuit pendant 2 minutes par centrifugation (≥8 600 x g) dans un tube stérile de microcentrifugation de 2 mL, retirer le surnageant, puis resuspendre le pellet cellulaire dans 900 μL de bouillon Luria-Bertani (LB) frais par pipettette.
   2. Ajoutez 900 μL de glycérol stérile à 60 % (v/v) à la culture et mélangez par vortex.
   3. Transférez le mélange dans un tube cryogénique stérile de 2 mL et conservez-le indéfiniment à -80 °C.
   4. Pour l’utiliser, retirez une petite quantité de bouillon congelé à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile et d’une strie pour les colonies individuelles sur des plaques d’agar LB. Retournez immédiatement le stock congelé à -80 °C après utilisation pour éviter que les cultures ne dégèlent complètement. Incubez les plaques côté couvercle vers le bas pendant 12 à 16 heures à 37 °C.
2. Croissance des cultures nocturnes dans un milieu liquide
   1. Strie pour les colonies individuelles (comme indiqué à la section 1.1.4) à partir de stock congelé sur des plaques d’agar LB. Incubez les plaques côté couvercle vers le bas pendant 12 à 16 heures à 37 °C.
   2. Inoculez 4 mL de bouillon LB liquide dans un tube de culture stérile de 10 mL avec une seule colonie en touchant la surface de la colonie unique avec un bâton applicateur stérile et en transférant la colonie dans le bouillon liquide.
   3. Incubez par aération dans un incubateur shaker à 225 tours par minute (tr/min) pendant 12 à 16 heures à 37 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
60 % de glycérol	Calbiochem	356352	http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
Agar-agar	Becto, Dickinson et Cie.	214030	http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Hcl	Fisher Scientific	A144-212	Corrosif; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
Le loop	Decon Labs Inc.	MP190-25	http://deconlabs.com/products/leloop/
Le stab	Decon Labs Inc.	MP186-5	http://deconlabs.com/products/lestab/
NaCl	Fisher Scientific	S271-10	https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
Plaques de Petri (100 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875712	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Tryptone	Becto, Dickinson et Cie.	211705	http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
Extrait de levure	Becto, Dickinson et Cie.	212750	http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch