Blocage de réplication médié par une protéine répressive marquée fluorescentement dans Escherichia coli

Dans cet article

Résumé

Source : Mettrick, K. A., Lawrence, et al., Induire un blocage de réplication spécifique au site chez E. coli à l’aide d’un système opérateur de répresseur fluorescent. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre un blocage de la fourche de réplication spécifique à un site chez Escherichia coli en utilisant l’expression induite par l’arabinose de TetR jaune fluorescent marqué par une protéine qui se lie aux réseaux chromosomiques de tetO.

Protocole

1. Blocage de la réplication avec un système opérateur de répresseur de fluorescence (FROS)

Induction du blocage de la réplication
1. Diluer une culture fraîche d’une souche d’E. coli transportant un réseau tetO et pKM118 jusqu’à_{OD 600}nm = 0,01 dans un milieu complexe dilué (0,1 % de tryptone, 0,05 % d’extrait de levure, 0,1 % de NaCl, 0,17 M_{KH 2}PO₄, 0,72 M_{K 2}_{HPO 4}) avec les antibiotiques nécessaires pour la sélection.
  NOTE: N’ajoutez pas de tétracycline pour la sélection car elle n’est pas compatible avec ce système. Faites en sorte que le volume de la culture soit équivalent à 10 ml par échantillon requis. Par exemple, le volume de culture pour le plan expérimental de la Figure 1 est de 60 ml.
2. Poussez à 30 °C avec secouage jusqu’à un OD₆₀₀ nm = 0,05-0,1. Retirez un échantillon de 10 ml pour servir de témoin non induit et ajoutez 0,1 % d’arabinose à la culture restante pour induire la production de TetR-YFP à partir de pKM1. Continuez à cultiver à la fois les cultures non induite et induite. Après 1 heure, vérifiez la présence d’un point focal unique dans chaque cellule de la culture induite à l’aide de la microscopie à fluorescence.
3. Si les cellules induites sont confirmées comme bloquées (plus de 70 % des cellules ont un seul foyer), enregistrez le OD₆₀₀nm et prélevez un échantillon de 7,5 ml pour analyse par gel 2D. Prélèvez un échantillon équivalent de la culture témoin non induite.

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Résultats

Figure 1 : Aperçu du bloc de réplication FROS et de la procédure expérimentale de libération. Les souches d’E. coli transportant le réseau tetO sont cultivées à 30 °C. Lorsque les cellules atteignent un OD_{de 600}nm supérieur ...