Amplification isotherme médiée par boucle pour la détection des gènes bactériens

Résumé

Source : Domesle, K. J., et al. Amplification isothermique médiée par boucle pour le dépistage de Salmonella dans la nourriture animale et la confirmation de Salmonella par isolement en culture. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo démontre la technique d’amplification isothermique médiée par boucle (LAMP) pour détecter un gène bactérien cible en amplifiant l’ADN à température constante. Le mélange réactionnel est préparé en ajoutant un mélange maître isotherme, des amorces spécifiques pour le gène cible et des échantillons contenant des modèles d’ADN. L’amplification est initiée dans un instrument LAMP, et la fluorescence en temps réel est surveillée pour confirmer la présence du gène cible.

Protocole

REMARQUE : Un mélange de réaction d’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) contient de l’ADN polymérase, un tampon, du sulfate de magnésium (_{MgSO 4}), des triphosphates désoxynucléotides (dNTPs), des amorces, un gabarit d’ADN et de l’eau. Les quatre premiers réactifs sont contenus dans un mélange maître isotherme (Table of Materials). Les amorces sont prémélangées en interne pour devenir un mélange d’apprêts (10 fois). Les modèles d’ADN peuvent être préparés à partir de bouillons d’enrichissement d’échantillons d’aliments animaux à des fins de dépistage ou à partir de cultures d’isolats présumés de Salmonella à des fins de confirmation. De plus, un témoin positif (ADN extrait de toute souche de référence de Salmonella , par exemple, Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) et un témoin sans gabarit (NTC ; eau de qualité moléculaire stérile) sont inclus dans chaque essai LAMP.

1. Préparation de modèles d’ADN

1. Pour préparer des modèles d’ADN issus d’enrichissements alimentaires pour animaux, suivez ces étapes.
   1. Pèser aseptiquement 25 g d’échantillons de nourriture animale (par exemple, nourriture sèche pour chats, nourriture sèche pour chien, nourriture pour bétail, nourriture pour chevaux, nourriture pour volailles et pour porcs) dans un sac filtre stérile (Table of Materials), ou équivalent. Placez le sac dans un grand récipient ou un support pour le soutenir pendant l’incubation.
   2. Ajoutez 225 mL d’eau à peptones stériles tamponnées (BPW). Mélangez bien en tourbillonnant et en massant brièvement les mains. Laissez reposer à température ambiante pendant 60 ± 5 minutes.
   3. Mélangez bien en faisant tourner et déterminez le pH avec un papier de test. Ajustez le pH, si nécessaire, à 6,8 ± 0,2 avec de l’hydroxyde de sodium stérile à 1 N (NaOH) ou à l’acide chlorhydrique 1 N (HCl). Incubez à 35 ± 2 °C pendant 24 ± 2 heures.
   4. Mélangez bien en faisant tourner le sachet contenant des bouillons d’enrichissement pour aliments animaux. Transférez 1 mL du côté filtré du sac vers un tube microcentrifuge. Vortex brièvement.
   5. Extraire l’ADN à l’aide d’un réactif de préparation d’échantillon (Tableau des matériaux) comme suit.
      1. Centrifugez à 900 x g pendant 1 minute pour retirer les grosses particules et transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge.
      2. Centrifugeuse à 16 000 x g pendant 2 minutes et jette le surnageant.
      3. Suspendez la pellete dans 100 μL du réactif de préparation de l’échantillon et chauffez à 100 ± 1 °C pendant 10 minutes dans un bloc chauffant sec.
      4. Refroidissez à température ambiante et conservez les extraits d’ADN à -20 °C.
2. Pour préparer des modèles d’ADN à partir de cultures présumées de Salmonella , suivez ces étapes.
   1. Obtenez des isolats présumés de Salmonella à partir de l’isolement en culture dans tous les aliments conformément au chapitre 5 de la FDA du BAM, section D sur la salmonelle : Isolement de la salmonelle.
   2. Inoculez les isolats présumés de Salmonella sur une plaque d’agar non sélective (par exemple, agare sanguine, agar nutritique et agar trypticase de soja) et incubez à 35 ± 2 °C pendant 24 ± 2 h.
   3. Transférez plusieurs colonies individuelles dans 5 mL de bouillon de soja trypticase (TSB) ou de bouillon d’infusion cérébrale (BHI) et incubez à 35 ± 2 °C pendant 16 ± 2 heures.
      REMARQUE : Cette étape peut être optionnelle si la culture présumée de Salmonella est pure. Dans ce cas, les gabarits d’ADN peuvent être préparés en suspendant plusieurs colonies individuelles dans 5 mL de TSB et en chauffant 500 μL de la suspension à 100 ± 1 °C pendant 10 minutes dans un bloc de chaleur sèche. Poursuivez avec l’étape 5 ci-dessous.
   4. Transférez 500 μL de la culture nocturne dans un tube de microcentrifuge et chauffez à 100 ± 1 °C pendant 10 minutes dans un bloc de chaleur sec.
   5. Refroidissez à température ambiante et stockez les extraits d’ADN isolés à -20 °C.
3. Pour préparer l’ADN témoin positif, suivez des étapes similaires à celles ci-dessus pour préparer des modèles d’ADN à partir de cultures présumées de Salmonella , avec une étape de dilution supplémentaire.
   1. Inoculez S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) ou toute souche de référence de Salmonella sur une plaque agar non sélective (par exemple, agar sanguin, agar nutritif et agar soja trypticase) et incubez à 35 ± 2 °C pendant 24 ± 2 h.
   2. Transférez plusieurs colonies individuelles dans 5 mL de bouillon TSB ou BHI et incubez à 35 ± 2 °C pendant 16 ± 2 h pour atteindre ~10⁹ UFC/mL.
   3. Diluez en série la culture nocturne dans de l’eau à 0,1 % de peptones pour obtenir ~10⁷ UFC/mL.
   4. Transférez 500 μL de cette dilution dans un tube de microcentrifuge et chauffez à 100 ± 1 °C pendant 10 minutes dans un bloc de chaleur sec.
   5. Refroidissez à température ambiante et stockez l’ADN témoin positif à -20 °C.

2. Préparation du mélange d’apprêt (10 fois)

1. Obtenir des amorces LAMP synthétisées commercialement (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF et Sal4-LB) avec une purification par désalement standard (Tableau 1). Préparez des solutions d’origine de chaque amorce (100 μM) en réhydratant l’amorce avec une quantité appropriée d’eau stérile de qualité moléculaire. Mélangez bien en vortexant pendant 10 secondes et conservez à -20 °C (-80 °C pour un stockage à long terme).
2. Préparez le mélange d’apprêts (10 fois) selon une feuille d’exercices (Tableau 2). Ajoutez des volumes appropriés de solutions de base d’amorces et d’eau stérile de qualité moléculaire dans un tube de microcentrifuge. Mélangez bien tous les réactifs en faisant un vortex pendant 10 s. Aliquotez le mélange 10x de l’amorce à 500 μL par tube de microcentrifuge et conservez à -20 °C.

3. Assemblage d’une réaction LAMP

REMARQUE : Pour éviter la contamination croisée, il est fortement recommandé de séparer physiquement les zones utilisées pour préparer le mélange maître LAMP et d’ajouter des gabarits d’ADN. La figure 1 est un diagramme LAMP.

1. Préparation et mise en place de la course
   1. Nettoyage du banc avec de l’isopropanol et une solution dégradant l’ADN et la DNase (Table of Materials). Nettoyez les pipettes et les supports pour bandes de tube (Table of Materials) avec la solution dégradante de l’ADN et de la DNase.
   2. Décongelez le mélange maître isothermique, le mélange d’amorce (10 fois), l’eau de qualité moléculaire, l’ADN de contrôle positif et les gabarits d’ADN à température ambiante.
   3. Allumez l’instrument LAMP (Table of Materials) et appuyez sur l’écran d’ouverture pour accéder à l’écran d’accueil. Suivez ces étapes pour créer une course.
      REMARQUE : Un modèle de l’instrument LAMP possède 2 blocs (A et B) avec 8 échantillons dans chaque bloc, et un autre modèle possède un seul bloc pouvant accueillir 8 échantillons (Table of Materials).
      1. Appuyez sur LAMP+Anneau et sélectionnez Éditer pour entrer les informations de l’échantillon.
         REMARQUE : Le profil de course par défaut du LAMP consiste en une amplification à 65 °C pendant 30 minutes et une phase de recuit de 98 °C à 80 °C avec un décrément de 0,05 °C par seconde.
      2. Appuyez sur chaque ligne d’échantillon pour activer le curseur et saisissez les informations d’échantillon pertinentes, en utilisant l’icône du bloc AB pour basculer entre les deux blocs d’instruments LAMP.
      3. Appuyez sur l’icône de vérification lorsque toutes les informations de l’échantillon ont été saisies.
         REMARQUE : En option, la configuration de la run (appelée « Profile », qui contient des informations d’exemple ainsi que le profil d’exécution par défaut du LAMP) peut être sauvegardée pour une utilisation ultérieure. Appuyez sur l’icône Enregistrer et donnez un nom unique au profil. Lors du test de ce même ensemble d’échantillons la prochaine fois, une nouvelle exécution peut être lancée en utilisant le profil sauvegardé. Appuyez sur l’icône Dossier en bas à gauche de l’écran d’accueil et sélectionnez Profil pour charger les profils sauvegardés.
2. Assemblage de réaction LAMP
   REMARQUE : Lorsque vous utilisez les deux blocs d’instruments LAMP (A et B, soit un total de 16 échantillons), préparez le master mix LAMP pour 18 échantillons. Si vous utilisez un seul bloc d’instruments LAMP (8 échantillons au total), préparez le master mix LAMP pour 10 échantillons. Pour d’autres numéros d’échantillon, ajustez le volume en conséquence pour prendre en compte la perte par pipetage. Incluez toujours un contrôle positif et un NTC à chaque exécution LAMP. Des tests en double de chaque échantillon lors de sorties LAMP indépendantes sont recommandés.
   1. Préparez le master mix LAMP selon une fiche de travail (Tableau 3). Ajoutez les volumes appropriés de mélange maître isothermique, de mélange d’amorce et d’eau de qualité moléculaire dans un tube microcentrifuge et faites un vortex délicatement pendant 3 secondes. Centrifugez brièvement.
   2. Placez la bande tubulaire dans le porte-bandes et distribuez 23 μL du mélange maître LAMP dans chaque puits.
   3. Vortex tous les modèles d’ADN et centrifugeuse brièvement. Ajoutez 2 μL de gabarit d’ADN au puits approprié et bouchez fermement.
   4. Retirez la bande de tube du support et faites un mouvement du poignet pour vous assurer que tous les réactifs se sont accumulés au fond du tube.
   5. Chargez la bande de tubes dans le(s) bloc(s) d’instruments LAMP, en veillant à ce que les bouchons soient bien bien fixés avant de fermer le couvercle.

4. Course LAMP

REMARQUE : Lors d’une exécution LAMP, les relevés de fluorescence sont obtenus via le canal FAM. Les valeurs de temps jusqu’au pic (Tmax ; min) sont déterminées automatiquement par l’instrument pour le moment où le rapport de fluorescence atteint la valeur maximale de la courbe du taux d’amplification. Le Tm (°C) est la température de fusion/recuit du produit amplifié final.

1. Cliquez sur l’icône Run en haut à droite de l’écran et sélectionnez le(s) bloc(s) contenant la ou les bandes de tubes pour lancer la course LAMP.
2. En option, pendant que la réaction est en cours, appuyez sur les onglets Température, Amplification et Recuisson pour observer les changements dynamiques de divers paramètres pendant la mise en œuvre du LAMP.
3. Une fois la série terminée, appuyez sur les onglets Amplification et Recuisson pour voir les courbes complètes d’amplification et de recuit, puis sur l’onglet Résultats pour voir les résultats.
4. En option, pour la tenue des registres, notez le numéro de course situé en haut à gauche de l’écran, en utilisant le format « numéro de number_run de série d’instrument », par exemple « GEN2-2209_0030 ».

Tableau 1 : Amorces LAMP pour le dépistage de Salmonella dans les aliments animaux et la confirmation de Salmonella par isolement en culture. Les amorces sont conçues selon la séquence Salmonella invA (numéro d’accès GenBank M90846).

Nom d’introduction	Description	Séquence (5'-3')	Longueur (pb)
Sal4-F3	Amorce externe avant	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	Amorce extérieure à l’envers	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Amorce interne avant	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Amorce interne à l’envers	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Amorce avant en boucle	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Amorce à boucle vers l’arrière	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Tableau 2 : Fiche d’exercices pour préparer le mélange d’apprêt LAMP (10 fois). Les amorces sont listées dans le Tableau 1.

Composant	Conc. d’origine (μM)	Mélange d’apprêt conc. (μM)	Volume (μL)
Amorce Sal4-F3	100	1	10
Amorce Sal4-B3	100	1	10
Amorce Sal4-FIP	100	18	180
Introduction Sal4-BIP	100	18	180
Amorce Sal4-LF	100	10	100
Amorce Sal4-LB	100	10	100
Eau de qualité moléculaire	N/A	N/A	420
Total	N/A	N/A	1000

Tableau 3 : Fiche d’exercices pour préparer le mélange de réaction LAMP. Le mélange d’amorces (10x) est préparé selon le Tableau 2 à l’aide de solutions d’origine de sous-couches listées dans le Tableau 1.

Composant	Conc.	Réaction finale conc.	Volume par échantillon (μL)	Volume pour 18 échantillons (μL)	Volume pour 10 échantillons (μL)
Mélange isothermique isothermique ISO-001	1,67x	1x	15	270	150
Mélange d’amorces	10x	1x	2.5	45	25
Eau de qualité moléculaire	N/A	N/A	5.5	99	55
Sous-total du master mix	N/A	N/A	23	414	230
Modèle ADN	N/A	N/A	2	N/A	N/A

Résultats

Figure 1 : Un schéma du flux de travail Salmonella LAMP.

Matériaux