Livraison par électroporation de biomolécules fluorescentes dans les cellules bactériennes

Résumé

Source : Aigrain, L., et al. Internalisation et observation de biomolécules fluorescentes chez des micro-organismes vivants via électroporation. J. Vis. Exp. (2015)

La vidéo montre la délivrance de biomolécules fluorescentes dans des cellules microbiennes électrocompétentes grâce à l’électroporation. Le processus commence par l’introduction d’ADN ou de protéines marqués par fluorophore dans une suspension cellulaire refroidie. Une impulsion haute tension est ensuite appliquée pour créer des pores membranaires temporaires, permettant l’entrée de la biomolécule dans le cytoplasme. Après la récupération, les cellules subissent un lavage et une filtration pour éliminer les molécules non internisées ou liées à la surface. Enfin, les cellules marquées sont montées pour l’imagerie par fluorescence afin de visualiser les composants intracellulaires.

Protocole

1. Électroporation

1. Incubation
   1. Ajoutez jusqu’à 5 μl de molécules marquées stockées dans un tampon pauvre en sel (< 50 mM de sel) à une seule aliquote de cellules compétentes (20 μl bactéries ou levure de 50 μl) et incubez pendant 10 minutes sur de la glace.
      NOTE: La concentration de molécules marquées fluorescentement dans les solutions d’origine et donc la quantité de molécules marquées ajoutées à la cellule avant l’électroporation sont directement corrélées à l’efficacité de charge (Figure 1 et Discussion). Comme certaines protéines sont moins compatibles avec des conditions pauvres en sel, la concentration de sel dans le tampon de stockage peut être augmentée, mais le volume de molécules marquées ajoutées aux cellules avant l’électroporation doit alors être diminué.
   2. Transférer le mélange de cellules et de biomolécules marquées dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie (espacement de 0,1 et 0,2 cm pour les bactéries et les levures, respectivement). Tapotez doucement la cuvette sur le banc pour éliminer les éventuelles bulles de la solution.
   3. Placez la cuvette dans l’électroporateur et appliquez une impulsion électrique haute tension à la solution (0,9 à 1,8 kV/cm, voir la section Discussion pour plus de détails sur le choix de la tension). Une telle impulsion forme des pores transitoires dans les membranes cellulaires, permettant aux biomolécules marquées de diffuser dans les cellules.
   4. Vérifiez que la constante de temps affichée sur l’électroporateur est comprise entre 4 et 6 ms. Des constantes de temps plus basses sont souvent dues à une concentration trop élevée de sel et/ou à la présence de bulles dans la cuvette, ce qui entraîne une charge très faible ou nulle des cellules.
2. Récupération
   1. Immédiatement après l’électroporation, ajoutez 500 μl de milieu riche tel que le bouillon super optimal avec répression catabolite (SOC), le milieu défini riche en EZ, l’extrait de levure Peptone Dextrose (YPD), ou tout autre milieu riche aux cellules.
   2. Incubez l’échantillon à 37 °C pour les bactéries et à 29 °C pour la levure pendant 2 à 10 minutes. Pour les mesures de viabilité, où l’utilisateur souhaite évaluer le pourcentage de cellules qui se développent et se divisent après électroporation, on utilise un temps de récupération plus long (jusqu’à 1 heure) car nous observons ces délais avant la première division cellulaire.
3. Étapes de lavage
   1. Lavez les cellules pour éliminer les biomolécules non internalisées en les faisant tourner pendant 1 minute à 3300 x g et 4 °C. Éliminez le surnageant et resuspendez les cellules dans une solution de 500 μl de solution physiologique tamponnée phosphatée (PBS).
      NOTE: Pour chaque échantillon, préparez un contrôle négatif des cellules incubées avec la même quantité de biomolécules marquées mais non électroporées et lavées exactement de la même manière que l’échantillon principal.
   2. Répétez les étapes précédentes 3 fois.
   3. Dans le cas de l’internalisation des protéines, il faut optimiser la procédure de lavage en fonction des propriétés et du comportement de la protéine marquée d’intérêt. Les étapes suivantes sont des exemples d’optimisations possibles :
      1. Effectuez les trois premiers cycles de lavage avec du PBS contenant 100 mM de NaCl et 0,005 % de Triton X-100 pour éliminer les protéines non intériorisées qui pourraient adhérer à la membrane cellulaire externe.
         1. Filtrez les cellules électroporées avec un filtre de 0,22 μm de diamètre de pore intégré dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml en pipettant les cellules électroporées dans le filtre. Centrifugez pendant 3 minutes à 800 x g et 4 °C. Jetez le filtre à travers. Ajoutez 500 μl de nouveau PBS sur les cellules et faites-les tourner à nouveau comme précédemment, puis répétez ces étapes une fois.
      2. Ajoutez une petite quantité de protéase K (10 ng dans 500 μl PBS) lors du premier cycle de lavage pour permettre la digestion de toute protéine non intériorisée.
   4. Faites tourner les cellules pendant 1 minute à 3300 x g et 4 °C. Écartez le surnageant et resuspendez les cellules dans 150 μl de PBS.
   5. Étalez la solution chargée de la cellule sur le coussinet d’agarose en retirant la couche supérieure et en étalant 10 μl de la cellule goutte par goutte. Remplacez une gaine de couverture propre et brûlée inutilisée (pas d’épaisseur 1,5, correspondant à la spécification de l’objectif du microscope) sur le dessus du tampon et appuyez très doucement sur la lame.
   6. Protégez les cellules électroporées de la lumière en stockant les tampons dans une boîte opaque tout en imageant différents échantillons.

Résultats

Figure 1 : Compter le nombre de molécules internalisées à l’aide d’une analyse de photoblanchiment. (A) Analyse de photoblanchiment monocellulaire. Exemples de traces de temps d’intensité de fluorescence (bleu : données br...

Matériaux