Préparation d’échantillons de Myxococcus xanthus pour l’imagerie de cellules vivantes

Résumé

Source : Schumacher, D., et al. Imagerie par cellule vivante par fluorescence du cycle cellulaire végétatif complet de la bactérie sociale à croissance lente Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre la préparation et l’imagerie de Myxococcus xanthus, une bactérie du sol à croissance lente. La culture est cultivée dans un milieu, appliquée sur une couche de couverture avec des microsphères fluorescentes, puis recouverte d’un coussinet d’agarose préchauffé pour soutenir l’hydratation et l’apport en nutriments. Cette configuration permet l’imagerie en temps réel à long terme et en accéléré des processus cellulaires lors de la division cellulaire bactérienne.

Protocole

1. Préparation des échantillons de microscopie

Note: Les cellules à observer par microscopie sont placées sur une gaine de microscope puis recouvertes d’un coussin d’agarose contenant des nutriments. La gaine de couverture est collée sur un cadre en plastique ou en métal pour assurer un support mécanique. En préparation de la microscopie, un grand tampon d’agarose/TPM/0,2 % CTT doit être préparé à l’avance, comme décrit aux étapes 2.1 à 2.3. Veuillez également consulter le tableau des matériaux pour les produits spécifiques utilisés ici.

1. Préparer 500 mL de tampon TPM (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM_{KH, 2}PO₄ pH 7,6, 8 mM_{MgSO 4}) et stériliser par autoclave ou filtre à l’aide d’un filtre à bout de bouteille.

NOTE: Le tampon stérile peut être conservé pendant plusieurs mois à température ambiante.

2. Préparer une solution microscopique d’agarose à 1 % contenant 0,2 % de CTT (mélanger 1 g d’agarose avec 80 mL de tampon TPM et 20 mL de milieu CTT à 1 %). Chauffez dans un four micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit fondue.

NOTE: Le taux de 0,2 % de CTT suffit à permettre aux cellules de croître et à prévenir la famine. Des concentrations plus élevées de CTT dans le milieu microscopique entraînent une fluorescence de fond élevée.

3. Remplir une boîte de Petri avec l’agarose fondue jusqu’à une épaisseur de 0,5 cm (pour une boîte de Petri de 11,5 cm x 11,5 cm carrés, environ 60 mL d’agarose fondu sont nécessaires) et laisser refroidir à température ambiante.

NOTE: Le tampon d’agarose peut être conservé à 4 °C dans un environnement humide pendant jusqu’à 2 jours.

1. Préchauffer le tampon à 1 % d’agarose/TPM/0,2 % CTT à 32 °C pendant au moins 15 minutes avant utilisation.

NOTE: Pour préparer les cellules à la microscopie, suivez les étapes 2.4 à 2.8.

4. Placer une housse en verre stérile (60 mm x 22 mm, épaisseur : 0,7 mm) sur un cadre en plastique ou en métal comportant un trou au centre (Figure 1A) ; Ce cadre sert de support mécanique pour la fine couverture et aide à réduire la dérive lors de la microscopie. Fixez la gaine de couverture au cadre avec du ruban adhésif.

1. Pour préparer le cadre, découper un cadre de 75 mm × 25 mm à partir d’une plaque métallique de 1 mm d’épaisseur, puis découper un trou de taille appropriée (20 mm × 30 mm dans cette expérience) au centre.

5. Ajouter 10 à 20 μL de cellules de M. xanthus à croissance exponentielle sur la gaine.

6. Ajouter des microsphères fluorescentes de 0,5 μm comme marqueurs fiduciaux aux cellules pour simplifier le suivi des cellules ou des protéines lors des enregistrements en accéléré.

1. Diluer les microsphères 1:100 dans un tampon TPM et les conserver à 4 °C pendant plusieurs mois. Secouez soigneusement avant l’utilisation et ajoutez 5 à 10 μL des microspheres diluées aux cellules.

NOTE: Ici, des microspheres fluorescentes dans tous les canaux fluorescents courants bleu, vert, jaune et rouge étaient utilisées.

7. Découper un petit coussinet d’environ la taille de la housse du grand tampon préchauffé à 1 % d’agarose/TPM/0,2 % CTT et placez-le sur les cellules (Figure 1B). Placez une couche de couverture sur le coussinet d’agarose à 1 %, TPM et 0,2 % CTT pour éviter l’évaporation et maintenir les cellules dans un environnement humide.

NOTE: La seule couverture empêchera une évaporation significative pendant au moins 2 heures. Pour les enregistrements en accéléré prolongé, le tampon à 1 % d’agarose/TPM/0,2 % CTT et le sandwich de couverture doivent être scellés avec un film de paraffine pour éviter l’évaporation.

8. Incuber l’échantillon de microscopie à 32 °C pendant 15 à 20 minutes pour permettre aux cellules de s’attacher au fond du tampon d’agarose. Ensuite, commencez les enregistrements de la microscopie en accéléré.

Résultats

Figure 1 : Schéma de l’installation expérimentale utilisée tout au long de cette étude. (A) Un cadre en métal ou en plastique sert de support à l’échantillon. Un cache-abri est fixé au cadre métallique avec du ruban adhésif ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMI6000B avec l’AFC	Microsystèmes Leica	11888945	Microscope à fluorescence inversé à champ large automatisé avec contrôle de mise au point adaptatif
Cadre de montage universel	Microsystèmes Leica	11532338	Porte-étage pour différentes tailles d’échantillons
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 huile PH3	Microsystèmes Leica	11506197	Objectif de contraste de phase
Appareil photo Orca Flash 4.0	Hamamatsu	11532952	Appareil photo sCMOS 4,0 mégapixels pour l’acquisition d’images
Ensemble de filtres TXR ET, k	Microsystèmes Leica	11504170	Ensemble de filtres à fluorescence, Ex : 560/40 Em : 645/75
Ensemble de filtres L5 ET, k	Microsystèmes Leica	11504166	Ensemble de filtre à fluorescence, Ex : 480/40 Em : 527/30
Ensemble de filtres YFP ET, k	Microsystèmes Leica	11504165	Ensemble de filtres à fluorescence, Ex : 500/20 Em : 535/30
ProScan III	Préalable	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Contrôleur d’automatisation du microscope avec centre de contrôle interactif
Source lumineuse EL 6000	Microsystèmes Leica	11504115	Source lumineuse externe de fluorescence
Incubateur BLX Noir	Pecon	11532830	Chambre d’incubation noire entourant le microscope
Tempcontrol 37-2 numérique	Microsystèmes Leica	11521719	Contrôle automatisé de la température pour chambre d’incubation
Sulfate de gentmycine	Carl Roth	233.4	Gentamycine
Oxytétracyline dihydrée	Sigma Aldrich	201-212-8	Oxytétracycline
Sulfate de kanamycine	Carl Roth	T832.3	Kanamycine
Filtre à bout de bouteille Filtropur BT25 0,2	Sarstedt	831,822,101	Filtre à bout de bouteille pour la stérilisation des tampons
Deckgläser	VWR	630-1592	Engourdi de couvercle en verre (60 x 22 mm, épaisseur : 0,7 mm)
Agarose Seakem LE	Lonza	50004	Agarose pour les lames de microscopie
Leica Metamorph AF	Microsystèmes Leica	11640901	Logiciels de contrôle de microscope et logiciels d’analyse d’images
Microspères de tétraspeck, 0,5 μm	ThermoFisher	T7281	Microsphères fluorescentes
Pétri	Greiner Bio-one	688102	Boîte de Pétri carrée de 120 mm x 120 mm x 17 mm pour les coussinets d’agarose
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casitone
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane	Carl Roth	AE15.2	Tris
Sulfate de magnésium heptahydrate	Carl Roth	P027.2	Sulfate de magnésium
Phosphate de dihydrogène de potassium p.a.	Carl Roth	3904.1	Phosphate de dihydrogène de potassium
Milieu CTT à 1 % : 1 % (en semaine) de bacto™ casitone BD, 10 mM de Tris-HCl ph 8,0, 1 mM tampon phosphate de potassium pH 7,6, 8 mM de MgSO₄			Milieu de culture pour M. xanthus
Tampon TPM : 10 mM Tris-HCl ph 8,0, 1 mM tampon phosphate de potassium pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Tampon pour la préparation des lames de microscopie pour M. xanthus