Analyse précise et à haut débit de la croissance bactérienne à l’aide d’un lecteur de microplaques

Abstract

Source : Kurokawa, M., et al. Analyse précise et à haut débit de la croissance bactérienne. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo démontre la quantification à haut débit de la croissance bactérienne à l’aide d’un lecteur de microplaques. Il décrit les étapes impliquées dans la préparation de la culture, la mesure de la densité optique et l’analyse de la dynamique de croissance.

Protocol

1. Enregistrement en temps réel de la croissance
   1. Dessinez un pictogramme de plaque à 96 puits (tableau 8 × 12) pour indiquer la position des échantillons de culture inoculée sur la plaque à 96 puits. Imprimez le tableau et utilisez-le comme référence pour l’expérience.
      NOTE: Les puits situés sur les bords de la microplaque ne doivent contenir que du milieu vierge en raison de l’évaporation.
   2. Placez une microplaque stérilisée à fond plat de 96 puits avec couvercle, des pointes de pipette P-1000 et 1000 μL, des pointes P-200 et 200 μL, plusieurs microtubes de 1,5 mL, une pipette multicanal 8 canaux, un réservoir de réactif stérilisé, M63 à température ambiante et les stocks de glycérol d’Escherichia coli sur un établi propre.
   3. Ajoutez environ 25 mL de M63 au réservoir de réactif. Utilisez ce réservoir pour toutes les étapes suivantes.
   4. Ajoutez 900 μL de M63 aux microtubes en préparation de la production de dilutions en série.
   5. Décongelez le stock de glycérol à température ambiante. Ajoutez 900 μL de M63 à la crosse de glycérol décongelée et au vortex. Cela entraîne une dilution de 10 fois le stock original de glycérol.
   6. Transférer 100 μL de la dilution de 10 fois vers un autre microtube contenant 900 μL de M63 et un vortex. Cela entraîne une dilution de 100 fois.
   7. Répétez l’étape 1,6 jusqu’à atteindre le nombre désiré de dilutions.
   8. Remplir les puits au bord de la microplaque avec 200 μL M63 à l’aide d’une pipette à 8 canaux (P-200).
      NOTE: Ces puits peuvent être utilisés comme blanc.
   9. Chargez 200 μL de chaque échantillon dilué préparé en étapes 1.4 à 1,7 vers les puits de microplaques selon le tableau de référence (étape 1.1). Manipulez les échantillons dilués avant de charger et chargez le même échantillon dans plusieurs puits à différents endroits de la plaque.
   10. Placez la microplaque à 96 puits sur le lecteur de plaques.
   11. Ouvrez « Lire maintenant » dans « Gestionnaire des tâches » et choisissez le programme. Cliquez sur « OK » pour commencer à mesurer. Enregistrez l’enregistrement comme un nouveau fichier expérimental pour l’analyse des données.

Materials