Analyse précise et à haut débit de la croissance bactérienne à l’aide d’un lecteur de microplaques

Résumé

Source : Kurokawa, M., et al. Analyse précise et à haut débit de la croissance bactérienne. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo démontre la quantification à haut débit de la croissance bactérienne à l’aide d’un lecteur de microplaques. Il décrit les étapes impliquées dans la préparation de la culture, la mesure de la densité optique et l’analyse de la dynamique de croissance.

Protocole

1. Enregistrement en temps réel de la croissance
   1. Dessinez un pictogramme de plaque à 96 puits (tableau 8 × 12) pour indiquer la position des échantillons de culture inoculée sur la plaque à 96 puits. Imprimez le tableau et utilisez-le comme référence pour l’expérience.
      NOTE: Les puits situés sur les bords de la microplaque ne doivent contenir que du milieu vierge en raison de l’évaporation.
   2. Placez une microplaque stérilisée à fond plat de 96 puits avec couvercle, des pointes de pipette P-1000 et 1000 μL, des pointes P-200 et 200 μL, plusieurs microtubes de 1,5 mL, une pipette multicanal 8 canaux, un réservoir de réactif stérilisé, M63 à température ambiante et les stocks de glycérol d’Escherichia coli sur un établi propre.
   3. Ajoutez environ 25 mL de M63 au réservoir de réactif. Utilisez ce réservoir pour toutes les étapes suivantes.
   4. Ajoutez 900 μL de M63 aux microtubes en préparation de la production de dilutions en série.
   5. Décongelez le stock de glycérol à température ambiante. Ajoutez 900 μL de M63 à la crosse de glycérol décongelée et au vortex. Cela entraîne une dilution de 10 fois le stock original de glycérol.
   6. Transférer 100 μL de la dilution de 10 fois vers un autre microtube contenant 900 μL de M63 et un vortex. Cela entraîne une dilution de 100 fois.
   7. Répétez l’étape 1,6 jusqu’à atteindre le nombre désiré de dilutions.
   8. Remplir les puits au bord de la microplaque avec 200 μL M63 à l’aide d’une pipette à 8 canaux (P-200).
      NOTE: Ces puits peuvent être utilisés comme blanc.
   9. Chargez 200 μL de chaque échantillon dilué préparé en étapes 1.4 à 1,7 vers les puits de microplaques selon le tableau de référence (étape 1.1). Manipulez les échantillons dilués avant de charger et chargez le même échantillon dans plusieurs puits à différents endroits de la plaque.
   10. Placez la microplaque à 96 puits sur le lecteur de plaques.
   11. Ouvrez « Lire maintenant » dans « Gestionnaire des tâches » et choisissez le programme. Cliquez sur « OK » pour commencer à mesurer. Enregistrez l’enregistrement comme un nouveau fichier expérimental pour l’analyse des données.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Phosphate de dipotassium	Wako	164-04295
Phosphate de monopotassium	Wako	166-04255
Sulfate d’ammonium	Wako	019-03435
Sulfate de magnésium heptahydré	Wako	138-00415
Thiamine-HCl	Wako	201-00852
Glucose	Wako	049-31165
Hcl	Wako	080-01066
Sulfate de fer (II) heptahydrate	Wako	094-01082
KOH	Wako	168-21815
Glycérol	Wako	075-00611
Pointes de pipette, 200 μL	WATSON	110-705Y
Pointes de pipette, 1 000 μL	WATSON	110-8040
Microtube (1,5 mL)	WATSON	131-715C
8 pipette multicanal	WATSON	NT-8200
Agitateur Pasorina	EN UN SEUL	2-4990-02
Cylindre en verre (200 mL)	EN UN SEUL	1-8562-07
Mesure de pH de précision	EN UN SEUL	AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200	GILSON	1-6855-05
Pipetman P-1000	GILSON	1-6855-06
Stand à microtubes	Biographie BM	801-02Y
Tourbillon	Biographie BM	BM-V1
Microplaque Corning Costar à 96 puits avec couvercle (fond plat, transparent)	Sigma-Aldrich	Corning, 3370
Réservoir de réactif Corning Costar (50 mL)	Sigma-Aldrich	Corning, 4870
EPOCH2	BioTek	2014-EP2-002 / EPOCH2T
Établi propre BIO	Panasonic	MCV-B131F
Souches bactériennes	l’organisation de banques de souche ; Projet national de ressources biologiques (NBRP) au Japon