Évaluation de l’activité des chaperones bactériennes via le dépliement thermique d’une protéine modèle

Résumé

Source : Dahl, J. et al. Détection de l’activité dépendante du pH d’Escherichia coli Chaperone HdeB In vitro et In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre un test basé sur un spectrophotomètre à fluorescence pour évaluer l’activité des chaperones sur une protéine substrat soumise à un stress acide et thermique. Il décrit les étapes pour surveiller le déploiement et l’agrégation du substrat par diffusion de la lumière, en comparant les conditions avec et sans le chaperon.

Protocole

1. Essai d’activité chaperonne utilisant la déshydrogénase de malate à déploiement thermique (MDH)

NOTE: L’influence du HdeB purifié sur l’agrégation de la malate déshydrogénase mitochondriale porcine (MDH) à différents niveaux de pH a été surveillée comme décrit ci-dessous. Toutes les concentrations de protéines listées font référence à la concentration de monomères.

1. Pour préparer la MDH, dialysez la MDH à 4 °C toute la nuit contre 4 L de tampon C (50 mM de phosphate de potassium, 50 mM de chlorure de sodium (NaCl), pH 7,5) et concentrez la protéine à environ 100 μM à l’aide d’unités de filtration centrifuges avec une limite de poids moléculaire de 30 kDa.
   NOTE: Une dialyse minutieuse de la MDH est nécessaire car la MDH est administrée sous forme de solution de sulfate d’ammonium.
2. Pour retirer les granulats, centrifugez la protéine pendant 20 minutes à 20 000 x g à 4 °C. Déterminez la concentration de MDH par absorption à 280 nm (ε_{280 nm} = 7 950 ^{M-1 cm-1}). Préparez des aliquotes de 50 μl de MDH et congelez rapidement les aliquotes pour le stockage.
3. Placez une cuvette de quartz de 1 ml dans un spectrophotomètre à fluorescence équipé de porte-échantillons et de brasseurs à température contrôlée. Réglez λ_ex/em à 350 nm.
4. Ajoutez des volumes appropriés de tampon D préchauffé (43 °C) (150 mM de phosphate de potassium, 150 mM de NaCl) aux valeurs de pH souhaitées (ici : pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 et pH 5,0) à la cuvette et réglez la température dans le porte-cuvette à 43 °C. Le volume total est de 1 000 μl.
5. Ajouter 12,5 μM de HdeB (ou alternativement, le même volume de tampon de stockage HdeB pour le contrôle du tampon) au tampon, suivi de l’ajout de 0,5 μM MDH. Commencez à surveiller la diffusion de la lumière. Incubez la réaction pendant 360 secondes pour permettre un déploiement suffisant de la MDH.
6. Augmentez le pH à 7 en ajoutant un volume de 0,16-0,34 de 2 M non tamponés_{K 2HPO 4} et continuez à enregistrer la diffusion de la lumière pendant encore 440 secondes.
7. Réglez l’étendue de l’agrégation de MDH enregistrée en l’absence de chaperon à un moment défini après la neutralisation (dorénavant 500 secondes, lorsque la diffusion maximale de la lumière de MDH a été observée) à 100 %. Normaliser l’activité de HdeB au signal de diffusion lumineuse de MDH en l’absence de HdeB à chaque valeur de pH indiquée.

Matériaux