Évaluation du rôle protecteur d’une chaperone activée par l’acide chez E. coli sous stress acide

Résumé

Source : Dahl, J., et al. Détection de l’activité dépendante du pH d’Escherichia coli Chaperone HdeB In vitro et In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre l’utilisation de cultures recombinantes d’E. coli pour évaluer l’effet protecteur d’une chaperonne activée par l’acide lors du stress acide. La surveillance de la croissance bactérienne révèle une survie accrue dans les cultures exprimant des chaperones par rapport aux témoins, soulignant le rôle des chaperones dans la stabilisation des protéines sous stress.

Protocole

1. Effet de la surexpression de la Chaperone HdeB sur la survie d’E. coli sous stress acide

REMARQUE : L’ADN génomique d’E. coli MG1655 a été isolé selon le protocole standard.

1. Amplifiez la chaperone hdeB à partir d’E. coli MG1655 par PCR en utilisant des amorces hdeB-BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT et hdeB-EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG AGG ATG ATG ATT TCA TCT CTC C.
2. Préparez la réaction PCR à 50 μl comme suit : 10 μl tampon de polymérase 5x, 200 μM dNTP, amorce JUD2 0,5 μM, amorce JUD5 0,5 μM, 150 ng d’ADN génomique MG1655, 0,5 μl ADN polymérase, ajouter_{ddH 2}O à 50 μl.
3. Effectuez l’amplification de la hdeB comme suit : Étape 1 : 5 min à 95 °C, 1 cycle ; étape 2 : 30 secondes à 95 °C, 30 secondes à 55 °C, 30 secondes à 72 °C, 40 cycles ; Étape 3 : 10 minutes à 72 °C.
4. Cloner le fragment PCR résultant dans les sites EcoRI et BamHI du plasmide pBAD18 en utilisant des méthodes standard pour le clonage des sites de restriction. Purifiez le plasmide à l’aide d’un kit de purification selon les instructions du fabricant. Vérifiez le plasmide résultant par séquençage.
5. Transformer le plasmide exprimant HdeB ou le vecteur vide de contrôle pBAD18 en souche BB7224 (ΔrpoH) (génotype : F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632( ::IS1) ptsF25 zhf ::Tn10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH ::kan⁺) utilisant des cellules chimiquement compétentes.
   NOTE: Cette souche est sensible à la température.
6. Après un choc thermique de 45 secondes à 42 °C et avant le plaque, incubez les cellules à 30 °C et 200 tr/min. Effectuer des séquations en colonie unique des clones positifs et incuber toute la nuit à 30 °C. Préparer une culture nocturne à 50 ml LB_Amp et cultiver les cellules à 200 tr/min et 30 °C.
7. Diluer les cultures pendant la nuit 40 fois en 25 ml LB_Amp et faire croître la bactérie en présence d’arabinose (Ara) à 0,5 % à 30 °C et 200 tr/min jusqu’à une overdose _{de 600 nm} = 1,0 pour induire l’expression de la protéine HdeB.
8. Pour les expériences de décalage de pH, utilisez LB_Amp+Ara pour diluer les cellules à une OD _{de 600 nm} de 0,5 et ajustez aux valeurs de pH respectives (ici : pH 2,0, pH 3,0 et pH 4,0) en ajoutant des volumes appropriés de 5 M HCl.
9. Après les temps indiqués (pH 2, 1 min ; pH 3, 2,5 min ; pH 4, 30 min), neutraliser les cultures en ajoutant les volumes appropriés de 5 M de NaOH.
10. Surveiller la croissance des cultures neutralisées en culture liquide pendant 12 heures à 30 °C à l’aide de mesures de O.D.

Matériaux