Extraction d’ADN génomique basée sur la lyse thermique à partir d’une bactérie pathogène

Résumé

Source : Gulla, S., et al. Analyse en tandem à nombre variable multi-locus de la bactérie poisson-pathogène Yersinia ruckeri par PCR multiplex et électrophorèse capillaire. J. Vis. Exp. (2019).

Ce protocole extrait l’ADN génomique de Yersinia ruckeri en suspendant les colonies isolées dans de l’eau ultrapure et en appliquant de la chaleur pour lyser les cellules. La centrifugation sépare le surnageant contenant de l’ADN des débris cellulaires, produisant ainsi de l’ADN modèle adapté au génotypage par PCR et à l’analyse épidémiologique.

Protocole

1. Culture bactérienne et extraction de l’ADN génomique

1. Semez des cultures pures de Y. ruckeri sur n’importe quel type d’agar approprié (les auteurs ont utilisé l’agar sanguin bovin à 5 %) et incubez à 22 °C pendant 1 à 2 jours, ou 15 °C pendant 3 à 4 jours.
2. À partir de chaque plaque d’agar, on choisit une colonie représentative unique avec une boucle d’inoculation et on le transfère dans des tubes centrifugeuses de 1,5 mL contenant 50 μL d’eau ultrapurifiée. Suspendez, formez un vortex brièvement, puis étouffez pendant 7 minutes sur un bloc chauffant à 100 °C.
3. Centrifugez à 16 000 x g pendant 3 minutes et utilisez une pipette pour transférer soigneusement le surnageant dans un tube centrifugeuse vide de 1,5 mL. Passer à l’étape suivante en utilisant le surnageant comme ADN modèle ou conserver à -20 °C jusqu’à ce moment.

Matériaux