Détection des agents pathogènes des poissons à l’aide de l’analyse par répétition en tandem à nombre variable (VNTR)

Abstract

Source : Gulla, S., et al. Analyse en tandem à nombre variable multi-locus de la bactérie poisson-pathogène Yersinia ruckeri par PCR multiplex et électrophorèse capillaire. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo illustre la procédure de séparation des amplicons à répétition en tandem (VNTR) marqués par fluorescence, dérivés d’une bactérie pathogène des poissons, en utilisant l’électrophorèse capillaire pour générer des profils électrophhérographiques spécifiques à chaque taille pour l’identification bactérienne.

Protocol

1. Installation et conditions de fonctionnement de l’électrophorèse capillaire

1. Après confirmation des amplicons PCR (réaction en chaîne par polymérase), diluez les produits PCR 1:10 (v/v) dans de l’eau purifiée. Scellez, mélangez et centrifugez brièvement.
2. En travaillant dans une armoire à fumée, préparez un volume de mélange maître composé de 9 μL de formamide et 0,5 μL de taille standard par produit PCR (prévoyez 10 % de volume excédentaire). Vortex brièvement et distribuer 9,5 μL dans des puits sur une plaque adaptée au système CE (électrophorèse capillaire) disponible, avant d’ajouter 0,5 μL de produit PCR dilué. Scellez, mélangez et centrifugez brièvement.
   PRUDENCE: Manipulez avec précaution. Le mélange de formamide avec de l’eau génère de l’acide formique, qui est toxique.
3. À l’aide d’un thermocycleur PCR, dénaturez les échantillons à 95 °C pendant 3 minutes avant de refroidir à 4 °C indéfiniment. Centrifugez brièvement et chargez la plaque sur un système CE calibré selon les instructions du fabricant.
4. Effectuer une analyse de fragments CE à l’aide de réactifs selon l’appareil choisi et les réglages suivants : 60 °C ; 5 s injections à 1,6 kV (32 V par cm) ; Durée de fonctionnement de 32 min à 15 kV (300 V par cm). L’analyse des fragments CE de 24 puits sur un 24 capillaires (50 cm) prendra généralement environ 50 minutes.

Materials