Détection des agents pathogènes des poissons à l’aide de l’analyse par répétition en tandem à nombre variable (VNTR)

Résumé

Source : Gulla, S., et al. Analyse en tandem à nombre variable multi-locus de la bactérie poisson-pathogène Yersinia ruckeri par PCR multiplex et électrophorèse capillaire. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo illustre la procédure de séparation des amplicons à répétition en tandem (VNTR) marqués par fluorescence, dérivés d’une bactérie pathogène des poissons, en utilisant l’électrophorèse capillaire pour générer des profils électrophhérographiques spécifiques à chaque taille pour l’identification bactérienne.

Protocole

1. Installation et conditions de fonctionnement de l’électrophorèse capillaire

1. Après confirmation des amplicons PCR (réaction en chaîne par polymérase), diluez les produits PCR 1:10 (v/v) dans de l’eau purifiée. Scellez, mélangez et centrifugez brièvement.
2. En travaillant dans une armoire à fumée, préparez un volume de mélange maître composé de 9 μL de formamide et 0,5 μL de taille standard par produit PCR (prévoyez 10 % de volume excédentaire). Vortex brièvement et distribuer 9,5 μL dans des puits sur une plaque adaptée au système CE (électrophorèse capillaire) disponible, avant d’ajouter 0,5 μL de produit PCR dilué. Scellez, mélangez et centrifugez brièvement.
   PRUDENCE: Manipulez avec précaution. Le mélange de formamide avec de l’eau génère de l’acide formique, qui est toxique.
3. À l’aide d’un thermocycleur PCR, dénaturez les échantillons à 95 °C pendant 3 minutes avant de refroidir à 4 °C indéfiniment. Centrifugez brièvement et chargez la plaque sur un système CE calibré selon les instructions du fabricant.
4. Effectuer une analyse de fragments CE à l’aide de réactifs selon l’appareil choisi et les réglages suivants : 60 °C ; 5 s injections à 1,6 kV (32 V par cm) ; Durée de fonctionnement de 32 min à 15 kV (300 V par cm). L’analyse des fragments CE de 24 puits sur un 24 capillaires (50 cm) prendra généralement environ 50 minutes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Analyseur génétique Avant 3500xL	Thermo Fisher Scientific	A30469	Utilisé pour l’analyse de fragments d’électrophorèse capillaire.
Modules BioNumerics7	Mathématiques appliquées	NA	Utilisé pour générer des arbres de couverture minimale à partir de données MLVA.
Centrifugeuse(s)	Comme on le souhaite.	NA
Tubes à verrouillage Eppendorf, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Des tubes centrifugeuses utilisés lors de l’extraction d’ADN.
Congélateur	Comme on le souhaite.	NA
Meuble à fumée	Comme on le souhaite.	NA
Logiciel GeneMapper 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Utilisé pour lire des électrophrégrammes à partir d’électrophorèse capillaire.
Norme standard de taille de colorant GeneScan 600 LIZ v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Norme de taille utilisée lors de l’électrophorèse capillaire.
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Formamide déionisée utilisée lors de l’électrophorèse capillaire. Préparez des aliquouts de travail.
Eau Milli-Q	NA	NA	Eau purifiée utilisée lors de la PCR et de l’électrophorèse capillaire. Recette standard ; produit en interne.
Multiplex PCR Plus Kit	Qiagen	206151/206152
Cycleur thermique PCR	Comme on le souhaite.	NA
Polymère POP-7 pour analyseurs génétiques 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Matrice de séparation utilisée lors de l’électrophorèse capillaire.
Culture pure Yersinia ruckeri	NA	NA	Par exemple, cryopréservé ou frais.
Eau sans RNase	Qiagen	NA	Entrée : Multiplex PCR Plus Kit
Tampon tris-borate-EDTA (TBE)	NA	NA	Recette standard ; produit en interne.
Agar de soja trypsine / agar sanguin bovin	NA	NA	Recette standard ; produit en interne.
Vortex	Comme on le souhaite.	NA