Exposer une communauté bactérienne orale synthétique à des phases simulées de digestion

Résumé

Source : Arroyo, M. C., et al. Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique à l’interface intestin-microbe in vitro . J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’évaluation de la viabilité d’une communauté microbienne orale synthétique lors d’une digestion orale, gastrique et intestinale simulée. La survie bactérienne est quantifiée après chaque phase, révélant un déclin progressif dû au stress digestif.

Protocole

1. Survie bactérienne après des conditions de transit gastro-intestinal in vitro

NOTE: Préparez des fluides digestion simulés avec les modifications décrites ci-dessous. Préparez toutes les dilutions avec de l’eau ultrapure. Filtrez toutes les solutions à travers un filtre de 0,22 μm et effectuez la procédure de digestion dans des conditions stériles.

1. Digestion orale :
   1. Placer 3 mL de la communauté bactérienne dans un tube stérile de 50 mL, mélanger avec 3 mL de liquide salive simulé (SSF), contenant en millimoles par litre (mmol L⁻¹) : chlorure de potassium (KCl), 15,1 ; Phosphate monopotassique (KH₂PO₄), 3,7 ; Bicarbonate de sodium (NaHCO₃), 6,8 ; Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl₂·6H₂O), 0,5, carbonate d’ammonium [(NH₄)₂CO₃], 0,06 ; Acide chlorhydrique (HCl), 1.1 ; Chlorure de calcium dihydré (CaCl₂·2H₂O), 0,75. Ajoutez 75 U/mL de α-amylase provenant de la salive humaine de type IX-A et 2 g/L de mucine provenant de l’estomac porcin (type II) à la SSF.
   2. Incubez le mélange pendant 2 minutes à 37 °C et 100 tr/min. Prélever un échantillon de 2 mL pour l’extraction d’ADN et la quantification par cytométrie en flux (S1).

2. Digestion gastrique :

1. Ajouter 4 mL de liquide gastrique simulé (SGF), contenant (en mmol L-1) : KCl, 6,9 ; KH₂PO₄, 0,9 ; NaHCO₃, 25 ; Chlorure de sodium (NaCl), 47,2 ; MgCl₂·6H₂O, 0,1, (NH₄)₂CO₃, 0,5 ; HCl, 15,6 ; CaCl₂·2H₂O, 0,075. De plus, le SGF contenait 2 g/L de mucine provenant de l’estomac porcin (type II).
2. Mesurez le pH et ajustez à 3 avec 1 molaire (1 M) de HCl, si nécessaire. Incuber à 37 °C et 100 tr/min. Prélève un échantillon de 2 mL (S2).

3. Digestion de l’intestin grêle :

1. Ajouter 4 mL de liquide intestinal simulé (SIF) contenant (dans le mmol L-1) : KCl, 6,8 ; KH₂PO₄, 0,8 ; NaHCO₃, 85 ; NaCl, 38,4 ; MgCl₂·6H₂O, 0,33 ; HCl, 8,4 ; CaCl₂·2H₂O, 0,3, au tube digestif.
2. Ajustez à un pH 7 avec 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH), si besoin. Incuber à 37 °C et 100 tr/min. Prélève un échantillon de 2 mL (S3).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mucine provenant de l’estomac porcin de type II	Sigma-Aldrich	M2378
PBS	Gibco	14190250
Millipore Milli-Q académique, système d’eau ultra pure	Millipore, Merck KGaA	-
Shaker incubateur InnOva 4080	École scientifique du Nouveau-Brunswick	8261-30-1007
Eau sans nucléase	Électrophorèse Serva	28539010
Cytomètre en flux BD Accuri C6	BD Biosciences	653118
Kit PCRpure InnuPREP	Analytik Jena	845-KS-5010250	Kit de purification PCR