Extraction d’ADN génomique à partir de tissu foliaire végétal infecté par des bactéries pathogènes

Résumé

Source : Gulla, S., et al. Analyse en tandem à nombre variable multi-locus de la bactérie poisson-pathogène Yersinia ruckeri par PCR multiplex et électrophorèse capillaire. J. Vis. Exp. (2019).

Ce protocole extrait l’ADN génomique de Yersinia ruckeri en suspendant les colonies isolées dans de l’eau ultrapure et en appliquant de la chaleur pour lyser les cellules. La centrifugation sépare le surnageant contenant de l’ADN des débris cellulaires, produisant ainsi de l’ADN modèle adapté au génotypage par PCR et à l’analyse épidémiologique.

Protocole

1. Culture bactérienne et extraction de l’ADN génomique

1. Semez des cultures pures de Y. ruckeri sur n’importe quel type d’agar approprié (les auteurs ont utilisé l’agar sanguin bovin à 5 %) et incubez à 22 °C pendant 1 à 2 jours, ou 15 °C pendant 3 à 4 jours.
2. À partir de chaque plaque d’agar, on choisit une colonie représentative unique avec une boucle d’inoculation et on le transfère dans des tubes centrifugeuses de 1,5 mL contenant 50 μL d’eau ultrapurifiée. Suspendez, formez un vortex brièvement, puis étouffez pendant 7 minutes sur un bloc chauffant à 100 °C.
3. Centrifugez à 16 000 x g pendant 3 minutes et utilisez une pipette pour transférer soigneusement le surnageant dans un tube centrifugeuse vide de 1,5 mL. Passer à l’étape suivante en utilisant le surnageant comme ADN modèle ou conserver à -20 °C jusqu’à ce moment.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de purification de l’ADN génomique Wizard	Promega	A1120	Source de la lyse des noyaux, de la RNase, de la précipitation des protéines et des solutions de réhydratation de l’ADN
Azote liquide	Produits d’air	N/A
Mastercycler Pro avec panneau de contrôle	Eppendorf	6321000019
Micro-ondes 1250 W	Panasonic	N/A
Centrifugeuse de table 5424	Eppendorf	05-403-93
Bain mariée numérique Isotemp 215	Fisher scientifique	15-462-15Q
Spatule métallique	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortier et pilon	Sigma-Aldrich	Z247464
Mélangeur vortex LSE	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Embouts stériles de 10 μL	TipOne	1161-3730
Embouts stériles de 200 μL	TipOne	1163-1730
Pointes stériles de 1250 μL	TipOne	1161-1750
Kit de pipettes à volume variable	VWR	75788-460
Bromure d’ethidium	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Acide acétique	Fisher Chemical	A38-212
Base Tris	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvette	Eppendorf	6138000018
Biospectromètre de base	Eppendorf	6135000009