Essai de superposition d’agar mou pour détecter la mort médiée par bactériocine chez Pseudomonas syringae

Résumé

Source : Hockett, K. L., et Baltrus, D. A. Utilisation de la technique de superposition à l’agar mou pour dépister les composés inhibiteurs produits par des bactéries. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo illustre la procédure pour détecter la mort médiée par la bactériocine en repérant le surnageant d’une souche donneuse induite par antibiotique sur une superposition d’agar mou contenant une souche test. Les zones claires formées après l’incubation indiquent une inhibition bactérienne.

Protocole

1. Préparation des superpositions et tests des surnatants pour l’activité

1. Inoculez une seule colonie d’une souche de P. syringae à tester pour la sensibilité dans 3 ml de KB (King’s medium B), incubez toute la nuit avec secouement à température ambiante.
2. Le lendemain matin, diluez la culture à 1/100 pour en obtenir un peu de ko. Incubez 3-4 heures en secouant à température ambiante.
3. Préparez de l’agar à l’eau stérilisée en autoclavant une suspension de 0,35-0,7 % (p/v) d’agar dans de l’eau ultrapure.
   NOTE: Un stock d’agar d’eau douce peut être fondu au micro-ondes et réutilisé à plusieurs reprises ; Une nouvelle superposition n’a pas besoin d’être préparée pour chaque expérience. Si l’agar d’eau est réutilisé, il est essentiel de s’assurer qu’il soit complètement fondu après le micro-ondes. Sinon, la superposition aura une texture granuleuse lors de la solidification, ce qui compliquera l’interprétation.
4. Avant utilisation, maintenez l’agar mou fondu dans un bain-marie à 60 °C. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, transférez 3 ml d’agar mou dans un tube de culture stérile. Remet le tube de culture dans le bain-marie pour maintenir l’état de fusion.
5. Pour verser la couche, laissez d’abord refroidir l’agar en fusion (il doit être chaud mais pas chaud au toucher), mais ne le laissez pas solidifier.
6. Dans une cagoule stérile, inoculez 100 μl de la culture de souche testeuse dans l’agar mou et le vortex pour le mélanger. Faites tourner la culture à la main pendant 10 à 15 secondes, puis versez sur un agar de fond (agar KB). Inclinez la plaque dans toutes les directions pour que l’agar tendre couvre uniformément l’agar inférieur.
   NOTE: L’agar de fond peut être n’importe quel milieu solidifié (1,5 % d’agar) sur lequel la souche test pousse vigoureusement. Pour une boîte de Pétri standard de 100 mm de diamètre, utilisez ~20 ml de substrat fondu. L’agar de fond peut être préparé plusieurs semaines à l’avance (s’il est maintenu à 4 °C sans sécher) ou peut être préparé le même jour.
7. Couvrez l’assiette et laissez-la solidifier pendant 20 à 30 minutes. Faites attention à ne pas abîmer la plaque pendant qu’elle se solidifie.
8. Une fois solidifié, placez 2 à 5 μl de surnageant sur la superposition. Laissez les plaques incuber toute la nuit à température ambiante. Observez et notez les résultats le lendemain matin.
   NOTE: Cela peut être utile pour effectuer et repérer une dilution en série du surnageant. Cela permettra aux chercheurs de distinguer entre l’activité de nettoyage bactériophage et bactériocine. Dans ce cas, il est recommandé de réaliser des dilutions 1:5 ou 1:10.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mitomycine C	Santa Cruz Biotechnologie	SC-3514	Cancérigène. Utilisez des équipements de protection adaptés (c’est-à-dire des gants, une protection oculaire et un masque facial), en particulier lors de la préparation de la solution d’origine.
Agar de qualité bactériologique	Genesee Scientific	20-274