Isolement des bactéries adaptées au stress par sélection de colonie unique

Résumé

Source : Jeong, H., et al. Procédure pour l’évolution adaptative en laboratoire des micro-organismes utilisant un chimiot. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo montre l’isolement sélectif et la croissance de bactéries adaptées au stress issues d’une culture exposée à des conditions de stress prolongées. La culture est placée sur un agar contenant un facteur de stress, et une seule colonie est sélectionnée pour inoculer un milieu liquide avec le stresseur. L’absorption est mesurée à intervalles réguliers pour surveiller la croissance et confirmer l’isolement réussi des bactéries adaptées au stress.

Protocole

1. Préparation de l’équipement

1. Procurez-vous un bocal de chimimostat (150-250 ml) ou une fiole Erlenmeyer (250 ml) contenant un orifice d’entrée et un orifice de sortie. Reliez les ports avec des tubes en silicium, permettant des débits de 10 à 100 ml/h. En option, utilisez une bouche d’aération, une sortie d’air et des entrées et sorties d’eau à température contrôlée.
2. Procurez-vous un dispositif adapté au bocal de chimimostate qui permet l’agitation et le contrôle de la température (ou utilisez un incubateur rotatif à secouement).
3. Obtenir deux pompes péristaltiques afin de fournir un milieu frais et de collecter la culture.
4. Procurez-vous un pot réservoir (10-20 L) contenant un orifice de sortie moyen et un orifice d’entrée d’air.
5. Obtenir un tube en silicium adapté au taux de dilution (c’est-à-dire diamètre 0,8 mm, plage de débit 0,06-36 ml/min ; L/S 13 tubulaires).

2. Préparation et stérilisation du milieu

1. Médium initial
   1. Dissoudre 0,3 g de glucose, 0,08 g de chlorure d’ammonium (NH₄Cl), 0,05 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,75 g de phosphate d’hydrogène disodium dihydré (Na₂HPO₄·2H₂O) et 0,3 g de phosphate d’hydrogène disodium (KH₂PO₄) dans 90 mL d’eau distillée (D.W.) dans un bocal de chimimostanat.
   2. Scellez le bocal de chimiste ainsi que le tube à l’aide de pinces. Ne scellez pas la bouche d’aération.
   3. Stérilisez le bocal de chimiste dans un autoclave à 121 °C pendant 15 minutes. Après la stérilisation, conservez le bocal de chimimostate à température ambiante.
   4. Dissoudre 0,02 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO_{4,7H 2}O), 0,01 g de chlorure de calcium (CaCl₂) et 0,1 mg de thiamine dans 10 mL de diamètre (solution A).
   5. Filtre la solution A à l’aide d’une seringue et d’un filtre à seringue pré-stérilisé (un filtre à pores de 0,45 μm).
   6. Ajoutez le filtrat de solution A dans le bocal de chimimostat.
2. Milieu de contrainte
   1. Dissoudre 30 g de glucose, 8 g de NH₄Cl, 5 g de NaCl, 75 g de_{Na 2}HPO₄·2H₂O, 30 g de_{KH 2}PO₄ et 300 g de succinate disodique hexahydrate (Na₂·succinate·6H₂O ; le facteur de stress utilisé dans cette expérience) dans 9,9 L D.W. dans un bocal réservoir.
   2. Scellez le bocal de réservoir ainsi que le tube à l’aide de pinces. Ne scellez pas la bouche d’aération.
   3. Stériliser le bocal réservoir dans un autoclave à 121 °C pendant 15 minutes. Après la stérilisation, conservez le bocal à température ambiante.
   4. Dissoudre 2 g de MgSO_{4,7H 2}O, 1 g de_{CaCl 2} et 10 mg de thiamine dans 100 ml de D.W. (solution A).
   5. Filtre la solution A avec une seringue et un filtre à seringue pré-stérilisé (un filtre à pores de 0,45 μm).
   6. Ajoutez le filtrat de solution A dans le bocal réservoir.
   7. Reliez aseptiquement le tube en silicium stérilisé au bocal réservoir et fixez les pompes péristaltiques.
3. Moyen à haute contrainte
   1. Préparez le milieu comme dans la section 2.2, mais avec une concentration de stress plus élevée (c’est-à-dire 3 à 5 g/L plus élevée dans l’adaptation succinée).
      Note : Ce protocole est destiné à l’adaptation à une contrainte pouvant être délivrée via le milieu. Dans le cas de facteurs de stress physiques tels que la température, l’agitation ou l’illumination, la culture doit être conçue en conséquence.

3. Culture initiale

1. Inoculez une seule colonie d’Escherichia coli de type sauvage (E. coli) dans un tube à essai de 15 ml contenant 4 ml de milieu initial.
2. Incubez le tube à essai dans un incubateur secouant pendant 12 heures à 37 °C et 220 tr/min.
3. Transférez aseptiquement 1 ml de préculture dans le pot de chimimostrat.
4. Incubez le pot de chimimostrat, qui permet l’aération (air 50 ml/min) et l’agitation (200 tr/min), à 37 °C pendant 6 heures.

4. Adaptation au stress

1. Reliez aseptiquement l’extrémité du tube en silicium des pompes au bocal de chimiot.
2. Démarrez la pompe de sortie (10 ml/h ou plus) et collectez la culture. Note : La culture doit être en phase exponentielle, généralement 4 à 8 heures après la culture initiale.
3. Vérifiez la densité optique (600 nm) de la culture provenant du tube de sortie.
4. Démarrez la pompe d’admission (10 ml/h, correspondant à un taux de dilution de 0,1 h-1).
5. Vérifiez la densité optique de la culture à 600 nm depuis le tuyau de sortie toutes les 24 heures.
6. Faites fonctionner le chémostat pendant 96 heures (un chiffre d’affaires de 9,6 fois) ou plus. Si la densité optique est stable, échangez le réservoir contenant le milieu à haute contrainte. Si la densité optique est inférieure à 0,2, arrêtez la pompe d’entrée d’alimentation pendant 6 heures. Redémarrez la pompe d’admission et vérifiez que la densité optique est supérieure à 0,2.
7. Augmentez progressivement la concentration du stresseur en passant à un réservoir contenant une concentration de contrainte plus élevée.
8. Prélève des échantillons de la culture adaptée chaque fois qu’elle atteint un jalon (par exemple, une souche adaptée à un stress succiné de 100 g/L), et stocke-les pour une analyse génomique ultérieure.
9. Pour le stockage de l’échantillon, mélangez l’échantillon de culture (0,5 ml) avec une solution stérilisée à 80 % de glycérol (0,5 ml) et conservez-le à -80 °C. Note : Si le micro-organisme acquiert la capacité de dégrader le facteur de stress lors du processus d’ALE, la concentration du facteur de stress dans le pot de fermentation n’est pas la même que dans le réservoir frais.

5. Isolation en colonie unique de la contrainte adaptée au stress

1. Préparez un milieu en plaques d’agar (1,6 % d’agar) contenant le même facteur de stress et à la même concentration de substrat.
2. Placez la culture de sortie (0,1 ml) du chimiostat et incubez à 37 °C pendant 16 heures.
3. Prélever des colonies individuelles de la plaque à l’aide d’un cure-dent stérile et les inoculer dans des tubes à essai de 15 ml contenant le même facteur de stress et à la même concentration moyenne que dans le chimiostat, puis incuber pendant 6 heures.
4. Transférez 1 ml de bouillon de culture dans une fiole Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de substrat. Récoltez 0,5 ml de bouillon de culture toutes les 1 heure, et mesurez l’overdose à 600 nm. Comparez le taux de croissance de la déformation adaptée à celui de la souche de type sauvage étant donné le facteur de stress.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fermentateur mini-chemostat	Biotron Inc.	-	Fabriqué sur commande spéciale
Tubulure en silicium	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	La taille du tube peut varier en fonction du taux de dilution et de la taille du pot de fermentation.
Jarre réservoir	Bellco	Bouteille de stockage de médias	20 L
Produits chimiques	Sigma-Aldrich	-	Qualité réactive
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	Réactif ACS
NH₄Cl	Sigma-Aldrich	A9434	pour la biologie moléculaire, adapté à la culture cellulaire, ≥ 99,5 %
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	Réactif ACS, ≥99 %
Na₂HPO₄·2H₂O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	795488	Réactif ACS, ≥99 %
MgSO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	230391	Réactif ACS, ≥98 %
CaCl₂	Sigma-Aldrich	793639	Réactif ACS, ≥96 %
Thiamine·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	Qualité réactive, ≥99 %
Na₂succinate·6H₂O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99 %