1. Collecte et stockage de l’eau et des coraux pour l’isolement microbien
NOTE: Il est essentiel de prendre les coordonnées et la température des sites d’échantillonnage. Si possible, des métadonnées telles que la salinité, le pH, la profondeur et l’intensité lumineuse peuvent également aider à trouver des approches de culture affinées et à interpréter les données à l’avenir. Pour des résultats fiables, conservez les échantillons le moins longtemps possible. Les microbiomes de l’eau/coraux peuvent changer considérablement si les échantillons ne sont pas conservés à la bonne température et/ou conservés pendant de longues périodes. Si l’étape d’isolation n’est pas effectuée immédiatement après la collecte, il est crucial de maintenir les échantillons à 4 °C jusqu’au traitement. Plus les échantillons sont stockés longtemps, même à 4 °C, plus la communauté microbienne évolue.
- Échantillonner et stocker l’eau de mer.
- Collectez 500 mL d’échantillons d’eau au moins triple exemplaires de chaque site ciblé. De préférence utilisez des bouteilles stériles avec des bouchons à vis.
- Si vous traitez l’eau immédiatement après la collecte, gardez les bouteilles en RT pendant un court intervalle. Si le traitement de l’échantillon a lieu plus tard, gardez les bouteilles à 4 °C.
- Échantillonner et stocker le corail.
- Utilisez une pince stérile pour couper des fragments de corail provenant du même site d’échantillonnage que les échantillons d’eau. Pour éviter toute contamination, ne touchez les coraux qu’avec des gants stériles.
- Rincez le fragment de corail échantillonné à l’aide d’une solution saline stérile de 20 mL (3 % de NaCl dans l’eau distillée) ou d’eau de mer artificielle pour éliminer les bactéries libres faiblement attachées à l’eau de mer.
- À l’aide de pinces, placez chaque fragment de corail dans un récipient stérile de 250−500 mL avec un bouchon à vis contenant une solution saline stérile.
- En laboratoire, à l’aide de pinces et de pinces stériles, pèser 5 g de fragments de corail à l’aide de boîtes de Petri stériles de 100 mm x 20 mm sur une balance.
- Transférez les 5 g d’échantillon de corail dans un mortier stérile et macérez-le à l’aide d’un pilon stérile.
- À l’aide d’une spatule stérile, transférez l’échantillon macéré dans une fiole de culture stérile contenant 45 mL de solution stérile de NaCl à 3 % et 10−15 billes de verre de 5 mm. Utilisez un peu de solution saline stérile de 45 mL pour laver le mortier et récupérer la quantité maximale de macérate.
- Maintenez les fioles sous agitation constante (150 x g) pendant 16 heures à la température de l’eau du site d’échantillonnage.
NOTE: Pour les coraux en eaux peu profondes, la température optimale varie entre 24 et 28 °C. Cette étape détachera les micro-organismes de différents compartiments coralliens, comme ceux attachés aux cellules hôtes, ou ceux vivant à l’intérieur du tissu et du squelette. Après cette étape, les macérats de corail ne doivent pas être stockés, et l’étape d’isolement doit être effectuée instantanément.
2. Isolement des bactéries synthétiques dégradant l’œstrogène 17a-éthinylestradiol (EE2) à partir de l’eau de mer et/ou des coraux
- Sélectionnez les bactéries.
NOTE: Après les étapes 1.1.2 et 1.2.7, la concentration de micro-organismes dans l’eau de mer qui se sont détachés des différents macérats coralliens sera inconnue et variable. Pour garantir l’isolement des colonies microbiennes individuelles dans des boîtes de Petri contenant des milieux d’agar, des dilutions en série sont nécessaires.- Effectuer des dilutions en série jusqu’à 10-9 dans une solution saline stérile pour les échantillons de coraux et jusqu’à 10-6 pour les échantillons d’eau. La pipette dilue 5 fois avant de jeter la pointe. Vortex échantillonne pendant 5 s à chaque fois avant d’effectuer la prochaine dilution sérielle.
- Pipettez 100 μL de chaque dilution sur des boîtes de Petri contenant un milieu agar de bouillon de lysogenèse NaCl (LB) à 3 %, puis dressez-les.
NOTE: Utilisez l’agar marin (MA) comme milieu alternatif. Des triples de chaque dilution sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables. - Incubez les plaques pendant 1 à 3 jours à la température cible (par exemple, 26 °C). Vérifiez les plaques une fois par jour.
- Sélectionnez et isolez les colonies présentant des morphologies de croissance distinctes sur de nouvelles plaques en utilisant la technique de la plaque striée. Répétez cette étape autant de fois que nécessaire pour que des colonies pures poussent sur les plaques.
- Si la procédure n’est pas immédiatement poursuivie à l’étape 2.3.1, conserver les isolats à 4 °C ou dans du glycérol comme décrit à la section 2.2.
- Préparez des stocks de glycérol.
NOTE: Cette étape est optionnelle et peut être utilisée pour le stockage à long terme des stocks bactériens.- Prenez des colonies individuelles sur la plaque fraîche ou sur les plaques stockées à 4 °C et inisez-les indépendamment dans 2 mL de milieu LB stérile.
- Placez les tubes sous agitation constante (150 x g) à 24−28 °C toute la nuit (ON).
- Ajoutez 1 mL des cultures bactériennes de l’étape 2.2.2 et du glycérol stérile à une concentration finale de 20 % pour les 2 mL de cryoviaux.
- Laissez les cryovials ALLUMÉS à 4 °C.
- Placez les stocks bactériens de glycérol à -80 °C jusqu’à ce que ce soit nécessaire.
- Effectuez le test de capacité de dégradation EE2.
- Activez les isolats dans le bouillon LB ou des médias alternatifs. Pour cela, choisissez une seule colonie dans les plaques fraîches ou la plaque stockée à 4 °C, et inoculez 2 mL de milieu LB stérile. Dans le cas où il s’agit d’un stock de glycérol, il faut d’abord le trier sur des plaques d’agar LB et incuber à 24−28 °C ON pour que des colonies uniques se développent. Placez le tube contenant le milieu LB incliné sous agitation constante (150 x g) à 24−28 °C ON.
- Après la croissance bactérienne, pelletez les cellules en les centrifugant à 8 000 x g pendant 8 minutes à température ambiante (RT). Jetez le surnageant et, en pipettant doucement de haut en bas, resuspendez les cellules dans un volume égal (2 mL) d’eau saline pour laver le bouillon LB restant.
- Répétez l’étape 2.3.2 deux fois pour garantir qu’il n’y a aucune trace de source de carbone, en resuspendant les cellules dans un volume égal de solution saline. Par exemple, si elle a commencé avec une culture de 2 mL, resuspendez les cellules dans un volume final de solution saline de 2 mL.
- Inoculez les cellules lavées et en suspension dans un milieu de culture Bushnell Haas minimal (BH Broth) contenant de l’EE2 comme seule source de carbone.
NOTE: L’EE2 est dissous dans l’éthanol à une concentration finale de 5 mg/L dans le milieu de culture. Modifiez le type de polluant et/ou la concentration si nécessaire. - Évaluer la croissance bactérienne par densité optique à 600 nm et/ou la formation d’unités de colonies (UFC) sur un milieu agar LB, pendant 16−72 h d’incubation.
NOTE: Alternativement, les micro-organismes peuvent être directement isolés sur un milieu minimal contenant EE2 ou d’autres composés comme seule source de carbone. Cette étape orienterait la sélection et éviterait une croissance indésirable.